Metabolic and transcriptomic response to hyperosmotic stimulus reveals strategies for optimization of antibody producing Chinese hamster ovary cells VonderFakultätEnergie-,Verfahrens-undBiotechnik derUniversitätStuttgartzurErlangungderWürdeeinesDoktors derNaturwissenschaften(Dr.rer.nat.)genehmigteAbhandlung Vorgelegtvon JenniferIsabellePfizenmaier-Wu geb.Pfizenmaier ausLudwigsburg Hauptberichter: Prof.Dr.-Ing.RalfTakors Mitberichter: Prof.Dr.MonilolaOlayioye TagdermündlichenPrüfung:18.April2017 InstitutfürBioverfahrenstechnik UniversitätStuttgart 2017 MEINERFAMILIE Danksagung Zunächst möchte ich meinem Doktorvater Herrn Prof. Dr.-Ing. Ralf Takors danken. Er hat es mir ermöglichtmeinePromotionaufdemspannendenGebietderZellkulturtechnikzuabsolvieren. Für seinestetsoffenstehendeTür,diekonstruktivenDiskussionenundnichtzuletztfürseinVertrauenin meineArbeitundmeineFähigkeitendankeichihmsehr. Prof.Dr.MonilolaOlayioyedankeichrechtherzlichfürihreBereitschaftdenMitberichtzuübernehmen. AllentechnischenAngestelltendankeichfürihreUnterstützungunddiestetsguteZusammenarbeit. HervorhebenmöchteichhierbeiAlexanderDietrich,dermirbeiallentechnischenFragestellungen währendderKultivierungenstetsmitRatundTatzurSeitestandunddafürsorgte,dasstrotzkurz- fristigangesetzterAbschaltungenvonGasen,DurckluftoderKühlwasserkeinAbbruchderProzesse notwendigwar. Dr. AttilaTelekidankeichfürseinengroßenundausdauerndenEinsatzzurMessungintrazellulärer MetabolitgehaltemittelsHILIC-ESI-MS/MS. LisaJunghans,Jens-ChristophMatuszczyk,ElenaBollgönnundMaxBeckerdankeichfürihreHilfe beidenzahlreichenFiltrationen. IndiesemZusammenhangdankeichinsbesondereLisaJunghans fürihreBereitschaftmitmirgemeinsamdieNachtzumTagzumachen. iv Elena Bollgönn danke ich für die Bearbeitung des Themas "Einfluss von Hyperosmolalität auf intrazelluläreATP-GehalteantikörperproduzierenderCHO-Zellen"imRahmenihrerBachelorarbeit. MeinenBürokollegenMaxBecker,LisaJunghans,Jens-ChristophMatuszczykundDr.JérémyRimbon dankeichfürdietolleundfröhlicheArbeitsatmosphäre,denWissenaustauschunddieVerpflegung mitNervennahrung. LisaJunghansdankeichfürdieAnmerkungenzumeinerArbeit. Annette Michalowski, Eugenia Hoffart, Michael Kraml und Ulrike Hillemann danke ich für die vielenunvergesslichen,fröhlichenundkulinarischenMittagspausen. MeingrößterDankgiltmeinerFamilie,insbesonderemeinenElternundmeinemEhemannJingbo. IhrstehtimmerhintermirundunterstütztmichinallenLebenslagen. VielenDankfüreuerVerständnis,eurenZuspruchundeureLiebe. v Table of Contents DeclarationofAcademicHonesty xi Nomenclature xii ListofFigures xviii ListofTables xix Abstract 1 Zusammenfassung 3 1 Introduction 5 2 TheoreticalBackground 9 2.1 ChineseHamsterOvaryCells . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 2.2 CellCycleandGenome . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 2.3 Mitochondria . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13 2.4 Metabolism . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18 2.5 IndustrialRelevanceofCHOCells . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27 2.6 Hyperosmolality . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41 2.7 Transcriptomics . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44 2.8 ImprovingCellularPerformanceofCHOCellsbyCellLineEngineering . . . . . . . . 51 3 MotivationandObjectives 53 vii TableofContents 4 MaterialsandMethods 59 4.1 Materials . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59 4.1.1 Chemicals . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59 4.1.2 Antibodies . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61 4.1.3 BuffersandSolutions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61 4.1.4 Consumables . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64 4.1.5 Software . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64 4.1.6 Equipment . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65 4.2 Methods . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67 4.2.1 CellLinesandAdaptation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67 4.2.2 BatchCultivationwithOsmoticShift . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67 4.2.3 FastFiltrationApproach . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69 4.2.4 ExtractionofIntracellularMetabolites . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70 4.2.5 AnalyticalMethods . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71 4.2.6 DeterminationofSpecificMetabolicRates . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79 4.2.7 Carbon/OxygenBalancingandCalculationofATPFormationRates . . . . . 81 4.2.8 CalculationofAdenineNucleotidePoolSizes . . . . . . . . . . . . . . . . . 83 4.2.9 CalculationofErrorsandStatistics . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 85 4.2.10 miRNAandmRNAExpressionAnalysis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86 5 Results 89 5.1 PhenotypeofCHODP-12CellsExposedtoHyperosmoticStimulus(+100mOsmolkg-1) 90 5.1.1 G1-phaseArrestandInhibitionofCellGrowthduetoHyperosmolality . . . . 90 5.1.2 MetabolicRatesIncreaseUponOsmoticShift . . . . . . . . . . . . . . . . 92 5.1.3 OsmoticUpshiftReducesTOM22-MediatedMitochondrialFluorescence . . 93 5.1.4 HyperosmoticallyStressedCellsShowEnhancedAvailabilityofATP . . . . . 95 5.1.5 ReliabilityoftheMitochondrialStainingProcedure . . . . . . . . . . . . . 99 5.2 OptimizationofExperimentalSetupforFurtherAnalyses . . . . . . . . . . . . . . . 101 5.2.1 DeterminationoftheTimeIntervalforAnalyses . . . . . . . . . . . . . . . 101 5.2.2 PreliminaryTranscriptomeAnalysis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103 5.2.3 IntensificationofHyperosmoticStress . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 111 viii TableofContents 5.3 MetabolicandTranscriptomicResponseofCHODP-12uponHyperosmoticStimulus (+150mOsmolkg-1)35hAfterInoculation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 116 5.3.1 ReducedCellGrowthHampersanIncreaseinc byEnhancedq . . . . . . . 116 P P 5.3.2 ChangesinMetabolicRates . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 119 5.3.3 Enhancedq andIncreasedATP-PoolsRevealaSurplusofEnergy . . . . . 122 ATP 5.3.4 QualityofRNAandNGSRawCounts . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 127 5.3.5 PrincipalComponentandDifferentialGeneExpressionAnalysis . . . . . . . 128 5.3.6 GeneExpressionDynamicsandRelationtoBiologicalFunction . . . . . . . 130 5.3.7 OsmoticUpshiftInducesUpregulationofSevenmiRNAs . . . . . . . . . . . 135 5.3.8 PredictionofPotentialmiRNATargets . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 136 5.4 HyperosmoticPhenotypeofaCellLinewithCHODG44Origin . . . . . . . . . . . . 139 5.4.1 HyperosmolalityEnhancesProductFormationRatesatReducedCellGrowth 139 5.4.2 OsmoticUpshiftIncreasestheNumberofBIBH1CellsinG1-Phase . . . . . . 141 5.4.3 HyperosmoticallyStressedBIBH1CellsShowEnhancedMetabolicActivity . 143 5.4.4 EnhancedATPFormationRatesDoNotResultinElevatedATP-Contents . . . 145 6 Discussion 149 6.1 HyperosmoticPhenotypeofCHODP-12Cells . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 149 6.1.1 CellGrowthandMetabolism . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 150 6.1.2 MitochondrialCompartmentandCellularEnergeticCapacity . . . . . . . . 152 6.1.3 CellLineSpecificity . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 156 6.2 OptimizationoftheExperimentalSetup . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 157 6.2.1 TimeofAnalysisandIntensifiedHyperosmoticStress . . . . . . . . . . . . 157 6.2.2 TranscriptomeAnalysis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 158 6.3 TranscriptionalResponseofCHODP-12CellsUponHyperosmoticStimulus . . . . . 159 6.3.1 ConservedGeneExpressionChanges . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 160 6.3.2 GeneExpressionDynamicsandRelationtotheHyperosmoticPhenotype . . 161 6.3.3 CorrelationsBetweenDifferentialmiRNAExpressionandtheHyperosmotic PhenotypeofCHODP-12Cells . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 164 6.3.4 CellLineEngineeringStrategies . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 166 ix TableofContents 6.4 ConclusionsandFuturePerspectives . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 168 7 AuthorContribution 171 References 173 A SupportingInformation 203 A.1 FiguresandDataofCultivations . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 203 A.2 TranscriptomicAnalysis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 214 A.2.1 QualityInformationforNextGenerationSequencing . . . . . . . . . . . . 214 A.2.2 RScriptformRNAExpressionAnalysis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 216 A.2.3 RScriptformiRNAExpressionAnalysis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 217 A.2.4 RScriptformaSigProAnalysis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 218 A.2.5 maSigProClustersforSignificantlyUpregulatedGenes . . . . . . . . . . . . 219 A.2.6 maSigProClustersforSignificantlyDownregulatedGenes . . . . . . . . . . 220 A.2.7 SignificantlyUpregulatedGenes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 222 A.2.8 SignificantlyDownregulatedGenes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 230 A.2.9 CHOspecificGeneExpressionChangesUponHyperosmoticStimulus . . . . 236 B Publications 237 B.1 Manuscript1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 237 B.2 Manuscript2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 247 C CompleteListofPublications 271 x