昆虫学报!"#$%&#’(’)’*+"$,+&+"$!!"#$%&’(!)*"*#$***+*31 -../&()(01%21 灰飞虱热激蛋白 S0#VI 基因的克隆" 序列分析与表达模式 张K青’!%! 陆明星’! 祝树德’!! "’:扬州大学园艺与植物保护学院!江苏扬州%%)&&2%%:苏州市农业科学院!江苏苏州%’)’))# 摘要! &目的’灰飞虱6$’01):9$<7#.+$#1))27"a6##}=#是水稻上的重要害虫!它严重影响了水稻的产量和品质!特别由 其传播的水稻条纹叶枯病毒对水稻的危害甚至更为严重( 灰飞虱分布广!对环境有很强的适应性( 本研究旨在探 讨灰飞虱对温度胁迫适应的分子机制进行了初步的探讨( &方法’本研究采用H^0V>H与HJ>4技术克隆了热激 蛋白RAB2&基因的全长!利用各种生物信息方法分析了该热激蛋白的特征!实时荧光定量 V>H技术用于研究 RAB2&基因在不同生长发育阶段和不同温度条件下表达变化规律( &结果’我们获得一条RAB2& 基因的;c/J全 长序列!命名为67A7:2&"W@=X6=]登录号为da11&%)&#( 67A7:2& 全长为% *(& GB!编码*%2 个氨基酸!等电点为 ):&!分子量为3,:* ]c6( 氨基酸序列中含有 RAB2&蛋白家族的)个签名序列及胞质特征序列 [44oc( 结构预测 表明PARAB2&具有RAB2&蛋白家族典型的结构特征( 系统进化关系分析表明它与多种昆虫的RAB2& 序列有较高 的同源性( 不同发育阶段的灰飞虱体内67A7:2&表达水平处于动态的变化过程中!并在(龄若虫期达到最大值!最 低表达量在其雌成虫阶段( 不同性别的灰飞虱成虫体内67A7:2&表达量有显著差异"4l&:&&3#( 高温和低温胁 迫都可以诱导灰飞虱体内67A7:2&的表达!最大的表达量分别在 (&N和+2N( 在(&N下处理不同时间后发现! 67A7:2&的表达水平在处理后&:) F 时最高!但随着时间的延长!67A7:2& 的表达水平逐渐降低( 而在 +(N下! 67A7:2&的表达水平在处理后’ F时达到最大值( &结论’灰飞虱体内的67A7:2&可以响应温度的诱导!它可能在灰 飞虱温度胁迫适应过程中起到重要的作用( 关键词! 灰飞虱% 热激蛋白2&% 基因克隆% 发育% 温度% 实时定量V>H 中图分类号! O211KK文献标识码! JKK文章编号!&()(01%21"%&’(#&*0&***0’& =(’*)*+! 0$W"$*&$,*,(.0)0,*3$M#%$00)’*#%’1)()*+ ’1/$,-0/’&X#%’-$)* VI +$*$ )* -/$ 05,((4%’2* #(,*-/’##$%! :)$%&(;7)8 2*".)*&((+2 "S$5)#-$%,$ T$(#/,&)3,$# QRJ/WO7=D’!%! PT[7=D0U7=D’! QRT.F"0c@’!!"’:.;F<<#<ZR<?E7;"#E"?@6=C V#6=EV?<E@;E7<=! u6=D_F<" T=7I@?A7E$! u6=D_F<"! !76=DA" %%)&&2! >F7=6% %:."_F<" J;6C@5$<ZJD?7;"#E"?@.;7@=;@A! ."_F<"! !76=DA" %’)’))! >F7=6# 740-%,&-$ &J75’ ^F@A56##G?<\= B#6=EF<BB@?6$’01):9$<7#.+$#1))27"a6##}=#! 6= 75B<?E6=E?7;@B@AE 7=A@;E! Z@@CA<= ?7;@6=C ;6"A@AEF@C@;?@6A@<Z$7@#C 6=C 9"6#7E$:4AB@;76##$EF@?7;@AE?7B@I7?"A E?6=A57EE@C G$657#.+$#1))277=C";@A5<?@A@?7<"A#<AA<Z?7;@:^F@A56##G?<\= B#6=EF<BB@?7A\7C@#$ C7AE?7G"E@C 6=C 6C6BEAE<I6?7<"A@=I7?<=5@=EA:^F7AAE"C$675AE<;#6?7Z$EF@5<#@;"#6?6C6BE7<= 5@;F6=7A5A<Z657#.+$#1))27"=C@?E@5B@?6E"?@AE?@AAB?@#757=6?7#$:&[@EF<CA’ JZ"##0#@=DEF ;c/J @=;<C7=DRAB2& Z?<5 657#.+$#1))27\6A;#<=@C "A7=DH^0V>H 6=C HJ>4 E@;F=79"@:c7ZZ@?@=E G7<7=Z<?56E7;A5@EF<CA\@?@"A@C E<6=6#$_@EF@;F6?6;E@?7AE7;A<ZRAB2&:^F@@‘B?@AA7<= #@I@#A<ZEF@ RAB2& D@=@65<=DC7ZZ@?@=EC@I@#<B5@=E6#AE6D@A6=C "=C@?C7ZZ@?@=EE@5B@?6E"?@A\@?@C@E@;E@C G$EF@ ?@6#0E75@V>H:&H@A"#EA’ ^F@;<5B#@E@;c/J <Z67A7:2& C@B<A7E@C 7= W@=X6=] 6;;@AA7<= =<: da11&%)& 7A% *(& GB 7= #@=DEF! \F7;F @=;<C@A6B?<E@7= <Z*%2 657=<6;7CA! \7EF EF@EF@<?@E7;6# 7A<@#@;E?7;B<7=E<Z):& 6=C 5<#@;"#6?\@7DFE<Z3,:* ]c6:^F@657=<6;7C A@9"@=;@;<=E67=AZ7I@ A7D=6E"?@A@9"@=;@A<ZRAB2& Z657#$6=C 6>0E@?57=6#;$E<B#6A57;;F6?6;E@?A@9"@=;@"44oc#:^F@ PARAB2& ;6??7@A6;#6AA7;RAB2& Z657#$AE?";E"?6#A7D=6E"?@:^F@BF$#<D@=7;E?@@C@5<=AE?6E@C EF6E 基金项目$国家科技支撑计划项目"%&’’XJc’1X&,#%苏州市科技支撑计划项目"./W%&’%&(# 作者简介$张青!男!’212年生!江苏扬州人!博士研究生!副研究员!研究方向为农业昆虫与害虫治理!40567#$_F6=D97=DA_8’1,:;<5 !通讯作者><??@AB<=C7=D6"EF<?!40567#$AC_F"8$_":@C":;= 收稿日期H@;@7I@C$%&’(0&(0%%%接受日期J;;@BE@C$%&’(0&10&3 KK**3 昆虫学报!"#$ %&#’(’)’*+"$ ,+&+"$ )*卷 PARAB2& F6AF7DF F<5<#<D$\7EF RAB2& B?<E@7=AZ?<5A<5@<EF@?7=A@;EAB@;7@A:^F@?@6#0E75@V>H 6=6#$A@A@‘F7G7E@C EF6EEF@@‘B?@AA7<= #@I@#A<Z67A7:2& I6?7@C ?@56?]6G#$7= C7ZZ@?@=EC@I@#<B5@=E6# AE6D@A:^F@5H/J#@I@#<GA@?I@C \6AEF@F7DF@AE7= EF@(EF 7=AE6?=$5BFA<Z657#.+$#1))27! EF@#<\@AE7= Z@56#@6C"#EA! 6=C AF<\@C A7D=7Z7;6=EC7ZZ@?@=;@AG@E\@@= 56#@6=C Z@56#@6C"#EA"4l&:&&3#:^F@ 67A7:2& 5H/J#@I@#<Z657#.+$#1))27;<"#C G@7=C";@C G$F@6E6=C ;<#C E@5B@?6E"?@AE?@AA:^F@F7DF@AE 67A7:2& 5H/J#@I@#\6A<GA@?I@C 6E(&N 6=C +2N! ?@AB@;E7I@#$:JE(&N! 67A7:2& 5H/J#@I@# ?@6;F@C 6B@6] 6E&:) F 6ZE@?E?@6E5@=E! 6=C EF@= C@;?@6A@C \7EF E?@6E5@=EE75@:R<\@I@?! 6E+(N! EF@B@6] <Z67A7:2& 5H/J#@I@#\6A<GA@?I@C 6E’ F 6ZE@?E?@6E5@=E:&><=;#"A7<=’ ^F@67A7:2& D@=@7= 657#.+$#1))27?@AB<=CAE<E@5B@?6E"?@AE?@AA! 6=C 7E56$B#6$6= 75B<?E6=E?<#@7= EF@6C6BE7<= B?<;@AA<Z EF@B@AEE<E@5B@?6E"?@AE?@AA: 8$. 2’%30$ 6$’01):9$<7#.+$#1))27% F@6EAF<;] B?<E@7= 2&% D@=@;#<=7=D% C@I@#<B5@=E% E@5B@?6E"?@% ?@6#0E75@9"6=E7E6E7I@V>H KK热激蛋白"F@6EAF<;] B?<E@7=A! R.VA#是一类广 机制仍然不清楚( 本研究从热激蛋白角度出发!探 泛分布!具有重要生物学意义的蛋白质( 它们的主 索了灰飞虱对温度胁迫适应的分子机制!通过研究 要功能是分子伴侣!参与蛋白质的合成)折叠)装配 获得了灰飞虱 RAB2& 基因的全长 ;c/J!并采用 及转运等生命活动"a@C@?6=C R<Z56==! ’222#( 根 9H^0V>H技术比较研究了灰飞虱 RAB2& 基因在不 据同源性与分子量大小!热激蛋白一般分为 同发育阶段和不同温度胁迫下的表达规律( 本研究 R.V’&&!R.V2&!R.V*&!R.V1&!R.V(& 和小分子量 结果将为深入研究灰飞虱的温度耐受性机制奠定基 热激蛋白"AR.V#等".b?@=A@= 1#$)5!%&&,#( 相对于 础!为进一步科学合理地制定该虫的综合防治策略 其他热激蛋白!有关R.V2& 的研究还相对较少( 而 提供理论依据( R.V2& 是一类在正常细胞中必不可少的蛋白质!参 与信号传递)维持蛋白平衡等"H"EF@?Z<?C 1#$)5! 9:材料与方法 %&&*% ^67B6#@1#$):! %&’&#( 另外!有研究表明 R.V2& 还可影响生物体的进化"O"@7EA;F 1#$):! 9;9:供试昆虫 %&&%#( 昆虫分布广泛!对生存环境具有很强的适 扬州大学园艺与植物保护学院提供的不携带条 应性( 温度是影响昆虫的发生)发展和分布最重要 纹叶枯病毒的灰飞虱种群!在养虫室内用武育粳* 的因素之一"X6#@1#$)5! %&&%% VF7#7B 1#$)5! %&&3#( 号稻苗饲养’& 代以上( 饲养条件为%1 i’N!相对 在长期进化过程中!昆虫形成了多种手段应对温度 湿度*&M!光周期’1Pj3c( 胁迫!例如通过调节休内热激蛋白的表达来抵抗不 9;<:灰飞虱S0#VI 基因的克隆 良温度".b?@=A@= 1#$)5! %&&,%崔亚东等! %&’&6! 9:<:9K灰飞虱总 H/J提取$ 用自制移虫器吸取) %&’&G% >"71#$)5! %&’&% P" 1#$)5! %&’(#( 龄灰飞虱若虫%& 头左右至’:) 5P无菌离心管内! 灰飞虱 6$’01):9$<7#.+$#1))27"a6##}=#属半翅目 迅速置于液氮罐中速冻!取出后加入到匀浆器中!按 飞虱科!是水稻)玉米和小麦的重要害虫!除直接刺 .o^<E6#H/J"V?<5@D6#分离纯化试剂盒程序提取 吸危害外!还能传播水稻条纹叶枯病毒"?7;@AE?7B@ 灰飞虱总H/J!使用琼脂糖凝胶电泳和微量分光光 I7?"A! H.o#等引起间接危害!造成巨大的产量损失 度计检测H/J的完整度)纯度与浓度( "蒲茂华!’21,%阮义理等!’23’%程兆邦等!%&&%#( 9:<:<KRAB2& 基因中间片段克隆$ 将经消毒无核 已有的研究表明!灰飞虱具有一定的耐高温)抗低温 酸酶的离心管置于冰上!参照 ;c/J反转录试剂盒 等抗逆能力!能在我国长江中下游水稻主产区以 "^F@?5<a7AF@?#步骤依次加入$% !P模板 H/J!’ , +)龄若虫越冬越夏"李济宸等! ’223%孙兴全等! !P引物<#7D<"C^# !加 c4V>水至’% !P( 然后在 ’3 %&&&%%刘向东等! %&&1! %&&*#( 灰飞虱( +) 龄若 上述离心管中依次加入$) !P[0[Po) hX"ZZ@?! 虫的过冷却点均在 +’&N以下!表现出较强的抗寒 ’:%) !PC/^VA[7‘E"?@"各 ’& 55<#kP#!’ !P[0 力"刘向东等!%&&*#( 高温不能抑制灰飞虱卵的发 [Po反转录酶和%:*) !PH/6A@0Z?@@CCRS( 将混 % 育!在’3 m,&N下卵的发育速率呈直线加快"张爱 合物瞬时离心置于(%N温育1& 57=!*&N!) 57= 终 民等!%&&3#( 但是!灰飞虱对不良温度适应的分子 止反应后!反应产物立即用于 V>H扩增或 +%&N *期 张K青等$ 灰飞虱热激蛋白RAB2&基因的克隆)序列分析与表达模式 KK**2 冻存( 找RAB2& 基因完整的开放阅读框( 然后在 SHa两 根据已有半翅目昆虫 RAB2& 基因序列!设计一 侧设计引物进行基因全长验证以确认其准确性( 使 对简并引物 PARAB2&a和 PARAB2&H"表’#( 在无 用.Y-..生物信息学研究所 4‘VJ.$分子生物学序 ’ ’ 菌V>H管中依次加入$%:) !P’& h^69 X"ZZ@?!% !P 列分析工具包括翻译)评估 B-k[Y和 X#6AE分析推 C/^VA!’ !P;c/J模板!上下游引物各 ’ !P! 导氨基酸序列( 使用 [4WJ):& 软件分别采用邻接 &:%) !P^69酶!用CCRS补齐至%) !P( 采用降落 法)最小进化法)最大似然法和最大简约法( 种方法 % V>H技术"E<";F C<\= V>H#扩增中间片段!反应体 构建灰飞虱系统进化树( 系$2(N预变性) 57=%2(N变性,& A!1)N ,& A!每 9:<:AKRAB2& 结构分析$ 使用蛋白同源比对识别 循环降低’N!*%N延伸’ 57=!共’2 个循环%然后 引擎 o%:& "FEEB$kk\\\:AGD:G7<:7;:6;:"]km 2(N变性,& A!()N ,& A!*&N延伸’ 57=!共%) 个 BF$?@%kFE5##产生同源模型"d@##@$6=C .E@?=G@?D! 循环%*%N延伸’& 57=!(N保存( 吸取) !PV>H产 %&&2#!采用VF$?@% 预测灰飞虱 RAB2& 的结构模型! 物琼脂糖凝胶电泳检测!检测到目的条带后将剩余 运用 >F75@?6软件调整三维模型和分子布局 V>H产物全部点样!进行琼脂糖凝胶电泳!纯化回 "V@EE@?A@= 1#$):! %&&(#( 收V>H产物( 在薄壁V>H管中依次加入( !P% h 9;?:不同发育阶段及不同温度胁迫下灰飞虱S0#VI H6B7C G"ZZ@?!( !P目的 c/J片段!’ !PBW4[0^ 基因表达差异分析 @6A$I@;E<?"V?<5@D6#!’ !P^( 连接酶!简单离心后 9:?:9K;c/J第一链的合成$ 选取蜕皮或羽化后’ 室温静置’ F!(N过夜( 吸取’&& !PcR)"感受态 C的灰飞虱’ +) 龄若虫或雌雄成虫各’& m,& 头为 细胞加入到连接产物管中!冰上放置&:) F!(%N热 ’ 个生物学处理!重复, 次( 不同温度处理均采用 击2& A后冰上放置 , 57=( 另取 ’:) 5P灭菌离 蜕皮后’ C的灰飞虱( 龄若虫( 高温处理"’ F#为$ 心管!加入’ 5PPX液体培养基!将加入感受态细 %3N! ,&N! ,%N! ,(N! ,1N! ,3N! (&N 和 胞的连接产物加入到液体培养基中!,*N,&& ?k57= (%N%另外在(&N下分别处理&:%)!&:) !’ !% !( 摇菌’ F!涂布在含 J5B7;7##7=kU0D6#k-V^W的 PX培 和 3 F( 低温处理"’ F#为%’N! ’1N! ’’N! 1N! 养基平板上!,*N倒置过夜!挑取 1 个阳性克隆 ’N! +(N和 +2N%另外 +(N下分别处理 &:%)! 在PX液体培养基"含 J[Vq#中!,*N振荡培养过 &:)! ’! %! ( 和3 F( 所有温度处理的灰飞虱用液 夜!菌液V>H初步验证后送菌液至上海英俊生物技 氮速冻后!按照’:%:’ 节方法提取 H/J!检验合格 术有限公司测序!每个片段送 , 个以上克隆进行 后用于反转录( 反转录采用 V?75@.;?7BEH^H@6D@=E 测序( d7EV@?Z@;EH@6#^75@试剂盒"X7<0H6C#的方法进行$ 9:<:?KRAB2& 基因HJ>4扩增$ 按>#<=E@;F公司的 ) h 7.;?7BE?@6;E7<= 57‘( !P! 7.;?7BE?@I@?A@ HJ>4J5B#7Z7;6E7<= d7E试剂盒要求合成 ;c/J第一 E?6=A;?7BE6A@’ !P!=";#@6A@0Z?@@RS’( !P!H/J模 % 链保存于 +%&N待用( 根据已扩增到的灰飞虱 板&:) !D( 反应条件$%)N ) 57=!(%N ,& 57=! RAB2& 基因中间片段!分别设计,fHJ>4引物和)f 3)N ) 57=( 产物立即使用或(N保存( HJ>4引物"表’#( ,f和)fHJ>4产物的扩增体系 9:?:<K引物设计与合成$ 根据灰飞虱 RAB2& 基因 为$&:) !P^6d6H6P6^69") Tk!P#!) !P’& hP6 全长设计用于荧光实时定量 V>H的引物一对 V>HX"ZZ@?%"[D%qZ?@@#!) !P[D>#"%) 55<#kP#! 9PARAB2&a和9PARAB2&H!并根据已扩增的灰飞虱 % ’ ’ 3 !PC/^VA[7‘E"?@"各 %:) 55<#kP#!% !P模板 &06;E7=部分序列设计内参基因引物"表’#!送上海 ";c/J#!% !P引物"’& !5<#kP#!) !PTV["’& 英俊生物技术有限公司合成( h#!%%:) !PH/6A@0Z?@@CCRS( 扩增条件为$2(N 9:?:?K实时定量分析$ 运用 .uXHW?@@= -嵌合荧 % ) 57=%2(N ,& A!13N ,& A!*%N % 57=!,) 个循环% 光法进行 ?@6#0E75@V>H分析( 使用 >a21UV>H仪 *%N延伸’& 57=!(N保存( V>H产物的检测)回收) "X7<0H6C# 进 行 V>H 反 应! 体 系 如 下$ 7^69^[ 连接)转化)测序均和中间片段扩增方法一致( T=7I@?A6#.uXH’ W?@@= A"B@?57‘"% h#’& !P!’& 9:<:@KRAB2& 基因序列拼接与分析$ 测序结果在 !5<#kP的上下游引物各 ’ !P!% !P;c/J模板!1 W@=X6=]中进行 X#6AE同源序列检索予以确认后用 !P灭菌CCRS( 反应条件为$2(N , 57=%2(N ,& % c/J[J/拼接得到基因全长( 利用 SHaa7=C@? A!^5"A7:2&$ )2:(N和!M$"#+&$ )3:)N#,& A!(& 个 "FEEB$kk\\\:=;G7:=#5:=7F:D<IkD<?ZkD<?Z:FE5##查 循环!反应结束后读取>E值( 使用梯度稀释的灰飞 KK*3& 昆虫学报!"#$ %&#’(’)’*+"$ ,+&+"$ )*卷 表9:本研究所使用引物 E,4($9:>%)5$%0$W"$*&$0"0$3)*-/)00-"3. 引物名称 引物序列")f+,f# 引物用途 V?75@?=65@ V?75@?A@9"@=;@ TA@<ZB?75@?A PARAB2&a ^^^WW^W^HWW^^^>^J>^>HW> 中间片段扩增 ’ PARAB2&H WW^>>JWJ^WWWu^^XW^u^^W -=E@?5@C76E@Z?6D5@=E65B#7Z7;6E7<= ’ PAHJ>4,f ^J>J>>WJWWJ^WJWWJW>^WJJ>J ,fHJ>4 PAHJ>4)f WWW^^^>^^W^>>JWJ^>WW>^^^W^ )fHJ>4 9PARAB2&a ^>W>>JJW^>JWWJJ>JJJWW H@6#0E75@V>H检测目的基因 ’ 9PARAB2&H >>JWW^J>W>>WJW^JWJJJ>> ^6?D@ED@=@C@E@;E7<=\7EF?@6#0E75@V>H ’ &06;E7=a W^>^>J>J>J>JW^>>>>J^>^J^W H@6#0E75@V>H检测内参基因 ’ &06;E7=H ^>WW^>JJW^>J>WJ>>JW> H@Z@?@=;@D@=@C@E@;E7<=\7EF?@6#0E75@V>H ’ 虱;c/J作为模板!进行?@6#0E75@V>H扩增反应!分 有(个保守的氨基酸44oc"第*%1 +*,& 位残基#"图 别制作 A7:2& 和 !M$"#+& 不同浓度的标准曲线!结果 ’#( 显示A7:2& 和 !M$"#+& 的扩增效率相同( 然后使用 <;<:J0S0#VI 蛋白结构分析 %+((>E法进行相对表达量分析!即先用 !M$"#+& 对 以酿酒酵母,$""9$.’(/"17"1.1G+7+$1RAB2& 蛋白 A7:2& 进行标准化!再用经过标准化的 A7:2& >E值 "VcX-c$ ;%;D2J#为模型!使用VF$?@预测PARAB2& 除以对照"雄成虫和%1N#的相应值!所得倍数就是 结构模型!两者的相似性为 3,M"’&&M置信度#( A7:2& 5H/J的相对水 平( 所 有 的 数 据 使 用 该模型显示PARAB2& 蛋白包含一个氨基段区域"/0 .V..’1:& 软件进行相关分析( E@?57=6#C<567=#)中间区域"57CC#@C<567=#和羧基 段区域">0E@?57=6#C<567=#"图%#( <:结果与分析 <;?:J0S0#VI 系统分析 序列相似性分析表明$PARAB2& 与褐飞虱 <;9:灰飞虱S0#VI 基因全长扩增与序列分析 O+)$:$.G$#$ )2*1&7"c)dUY*#和白背飞虱 ,’*$#1))$ 以灰飞 虱 的 ;c/J 为 模 板! 以 简 并 引 物 ;2."+;1.$"-,T--%#的 RAB2& 氨基酸序列的一致性最 PARAB2&a和PARAB2&H 进行 V>H扩增!获得一条 高!达2,M( 以人类A’(’7$:+1&7RAB2& 为外群!将 ’ ’ 约1&& GB的特异性条带( 扩增产物回收)克隆)测 来自半翅目)鳞翅目)直翅目)膜翅目)缨翅目)双翅 序后!经 X#6AE比对!发现该核苷酸序列与其他昆虫 目)鞘翅目等%2 种昆虫的RAB2& 氨基酸序列进行完 的 A7:2& 序列具有高度相似性!推测其为灰飞虱 全比对!基于 [4WJ):& 采用邻接法)最小进化法) A7:2& 的中间片段!长度为1’( GB( 根据该片段设 最大简约法和最大似然法构建了系统发育树( 获得 计 灰 飞 虱 RAB2& 基 因 ;c/J 的 HJ>4 引 物 了一致的系统发育关系!因此本文只显示用邻接法 PAHJ>4,f和 PAHJ>4)f进行 HJ>4扩增!分别得到 构建的系统发育树!结果表明灰飞虱与褐飞虱和白 23& GB ,f端序列和 ’ 3%, GB 的 )f端序列( 经 背飞虱的RAB2&单独聚为一支!并且所有的半翅目昆 c/J[J/拼接获得一个 % *(& GB 的灰飞虱 RAB2& 虫RAB2&都聚集在一起( 同时!所有用于构建系统发 基因;c/J序列全长!命名为 67A7:2&"W@=X6=] 登录 育树的鳞翅目昆虫RAB2&也聚类在一起"图,#( 号$da11&%)&#( 其,fT^H末端具有典型的B#<$J结 <;@:不同发育阶段灰飞虱体内:2<2;VI的表达变化 构!在B#<$J上游’1 GB 处具有’ 个多聚腺苷酸结构 不同发育阶段的灰飞虱体内 67A7:2& 的表达水 JJ^JJJ"图’#( 它的开放阅读框长%’3* GB!编码*%2 平处于动态的变化过程( 随着灰飞虱龄期不断的增 个氨基酸!分子量3,:* ]c!等电点):&( PARAB2& 具有 加!67A7:2& 的表达量逐渐增多!在( 龄若虫时达到 RAB2& 蛋白家族特征签名序列$u./d4-aPH4P-./0 最大值( ( 龄若虫体内的 67A7:2& 基因表达量要显 ..cJPcd-H"第,, +)) 位残基#)PW^-Jd.W^"第’&’ + 著高于) 龄若虫"= l*:)&2%4l&:&&’#( 在整 1!’( ’&2位残基#)-WOaWoWau.JuPoJc"第’%1 +’(’ 位残 个发育阶段 67A7:2& 的最低表达量是在雌成虫阶 基#) -dPuoHHoa-"第 ,)* +,11 位 残 基# 和 段!而雄成虫的 67A7:2& 的表达水平显著高于雌成 Wooc.4cPVP/-.H4"第,3,+,23位残基#!在>0末端具 虫"= l*:)&2%4l&:&&3#"图(#( 1!’( *期 张K青等$ 灰飞虱热激蛋白RAB2&基因的克隆)序列分析与表达模式 KK*3’ 图’K灰飞虱RAB2&基因的碱基序列和氨基酸序列 a7D:’K/";#@<E7C@6=C C@C";@C 657=<6;7C A@9"@=;@A<ZRAB2& D@=@Z?<56$’01):9$<7#.+$#1))27 粗斜体部分表示热激蛋白2&家族特征序列%双划线部分表示细胞质RAB2&特征基序%单划线部分表示多聚腺甘酸信号序列"JJ^JJJ#( ^F@ A7D=6E"?@A@9"@=;@A<ZRAB2& Z657#$6?@7=C7;6E@C 7= G<#C 6=C 7E6#7;! ;$E<B#6A57;RAB2& A7D=6E"?@5<E7Z7AC<"G#@"=C@?#7=@C! 6=C EF@B"E6E7I@ B<#$6C@=$#6E7<=A7D=6#"JJ^JJJ# 7A"=C@?#7=@C: <;A:不同温度胁迫下灰飞虱@龄若虫体内:2<2;VI 倍( 随着温度的降低!67A7:2& 的表达量不断增加! 的表达变化 并在 +2N达到最大值!是 %1N时的 (:1( 倍( KK不管高温还是低温都可以诱导灰飞虱体内 67A7:2& 在,1N时的表达量显著高于%1N的表达量 67A7:2& 的表达( 高温和低温的表达趋势不完全一 "= l,:21&%4l&:&%&#( 同时!67A7:2& 在%’N ’)!,’ 致( 随着温度的不断升高!67A7:2& 的表达量持续增 时的表达量显著低于’N的表达量"= l,:21&% ’)!,’ 加!并在(&N达到最大值!是%1N时表达量的1:*3 4l&:&&)#"图)#( KK*3% 昆虫学报!"#$ %&#’(’)’*+"$ ,+&+"$ )*卷 ?:讨论 灰飞虱是我国长江流域重要的水稻害虫!近几 年该虫仍在局部地区对水稻造成严重为害甚至绝 收( 因为气候变化的影响!越来越多的极端温度不 断出现"c7ZZ@=G6"DF 1#$)5!%&&)#( 灰飞虱对温度的 适应能力逐渐增强"张爱民等! %&&3#!但是其中的 分子机制还鲜有报道( 而热激蛋白是一类应对环境 胁迫的重要蛋白".<=<C61#$)5! %&&1% H7=@F6?E1# $)5! %&&*#( 本研究利用 H^0V>H和 HJ>4技术成 功克隆得到第一个灰飞虱RAB2& 基因;c/J全长序 列!将其命名为67A7:2&( 它的氨基酸推导序列具有 ) 个RAB2& 蛋白家族的特征序列!>端最末端拥有 高度保守的基序 44oc!表明此 R.V2& 是细胞质热 激蛋白家族成员"W"BE6! ’22)#( 灰飞虱 PARAB2& 的结构预测也表明其具有 RAB2& 蛋白家族保守的 典型结构组成"J#71#$)5! %&&1#( 由于昆虫的 RAB2& 蛋白高度保守!因此它们常常用于物种间的 系统进化分析( 本研究也表明PARAB2& 与其他物种 的RAB2& 蛋白具有高度的相似性( 利用包括灰飞 虱在内的%2 种昆虫的 RAB2& 全长氨基酸序列进行 图%K灰飞虱RAB2&的结构预测 的系统发育分析结果表明!用于构建系统进化树的 a7D:%K.E?";E"?@<ZRAB2& Z?<56$’01):9$<7#.+$#1))27 %* 种昆虫都按照传统方法获得的系统发育关系聚 J$以酵母菌R.V2&"VcX-c$ ;%;D2J#"黄色#为模板!用VF$?@%预 测灰飞虱R.V2& 的结构模型"蓝绿色#R<5<#<D$5<C@#7=D<ZRAB2& 类!这说明RAB2& 基因可以作为用于物种系统进化 Z?<5657#.+$#1))27";$6=# \6AB?@C7;E@C \7EF $@6AERAB2& "VcX-c$ 分析的分子标记基因( ;%;D2J# "$@##<\# 6AEF@E@5B#6E@"A7=DVF$?@% A<ZE\6?@% X$ 灰飞虱 已有研究发现热激蛋白在调控昆虫生长发育方 RAB2&结构分为氨基端"蓝色#)中间部分"蓝绿色#和羧基端"青色# 面起到重要的作用"W@=@I7~I@6=C H<G@?E! %&&,% ^F?@@0C75@=A7<=6#AE?";E"?@<ZRAB2& Z?<5657#.+$#1))277=;#"C@A/0 .F6?561#$)5! %&&*#( 在整个发育阶段灰飞虱 E@?57=6#C<567= "7= G#"@#! 57CC#@C<567= "7= ;$6=# 6=C >0E@?57=6# C<567="7=D?@@=#: 67A7:2& 表达量在( 龄若虫时达到最大值!这与该昆 虫以, +( 龄若虫越冬)越夏相吻合( 67A7:2& 的最 <;B:不同持续时间高低温胁迫下灰飞虱@ 龄若虫 低表达量是在雌成虫阶段!而 .F" 等"%&’’#在斜纹 体内:2<2;VI 的表达变化 夜蛾 ,:’0’:#1.$ )+#2.$ 中发现 RAB2& 基因的最高表 KK灰飞虱( 龄若虫在(&N条件下!经过不同持续 达是在成虫阶段( 也有一些研究发现 RAB2& 基因 时间处理后发现 67A7:2& 的表达水平在处理后&:) 在昆虫的整个发育阶段没有发生显著的变化 F时达到最大值!是对照的’&:2( 倍!并且显著高于 ".<=<C61#$)5!%&&1#( 可见RAB2& 蛋白在不同昆虫 处理后 % F 时的表达水平"= l’’:1%)%4L 生长发育中有着种的特异性!每种昆虫的 RAB2& 蛋 1!’( &:&&’#%随着处理时间的延长!67A7:2& 的表达水平 白都有其不同的生物功能( 有趣的是 67A7:2& 的表 逐渐降低( 然而!在 +(N下不同持续时间处理后! 达存在性别差异!类似的现象也在水稻二化螟 89+)’ 67A7:2& 的表达模式与(&N不同!67A7:2& 的表达量 72::.177$)+7中被发现"P" 1#$)5! %&’(#( RAB2& 蛋白 在处理后’ F时达到最大值!显著高于处理后&:) F 可能还参与昆虫的生殖调控!其在灰飞虱中的这类 时的表达量"= l’3:*,)%4L&:&&’#%但% +3 F 作用机制仍需进一步研究( 1!’( 时间段的处理并没有显著诱导67A7:2& 的表达"4p RAB2& 是真核细胞中最丰富的蛋白质之一!一 &:&)#"图1#( 些研究已经证实了热激蛋白在抵抗冷热胁迫中的作 *期 张K青等$ 灰飞虱热激蛋白RAB2&基因的克隆)序列分析与表达模式 KK*3, 图,K用邻接法构建的灰飞虱RAB2&与其他昆虫RAB2&的系统进化树 a7D:,K/@7DFG<"?0w<7=7=DBF$#<D@=@E7;E?@@<ZEF@RAB2& B?<E@7=AZ?<56$’01):9$<7#.+$#1))276=C <EF@?7=A@;EA 各分支上的数字为自引导值"’&&&次重复#"仅显示p)&的值#/"5G@?A<= EF@G?6=;F@A6?@EF@G<<EAE?6B I6#"@A<GE67=@C Z?<5’ &&& ?@B#7;6E@A "<=#$G<<EAE?6BI6#"@Ap)&6?@AF<\=#:RAB2&的来源及登录号S?7D7=<ZRAB2&B?<E@7=A6=CEF@7?6;;@AA7<=="5G@?A$人类A’(’7$:+1&7"V&3%,3#% 灰飞虱6$’01):9$<7#.+$#1))2A"da11&%)&#% 褐飞虱 O+)$:$.G$#$ )2*1&7"c)dUY*#% 白背飞虱 ,’*$#1))$ ;2."+;1.$ "-,T--%#% 乌苏里拟寰螽 4$.$#)$&#+"272772.+1&7+7"!*aUo*#% 甜菜夜蛾 ,:’0’:#1.$ 1<+*2$ ">(V,O&#% 斜纹夜蛾 ,:’0’:#1.$ )+#2.$ "4&U!d)#% 粘虫 J/#9+(&$ 71:$.$#$ "4&U!d*#%二化螟89+)’72::.177$)+7"O,o1>1#%亚洲玉米螟@7#.+&+$;2.&$"$)+7"4&U!d(#%甘蓝夜蛾J$(17#.$3.$77+"$1"O&ddX)#%草地贪夜 蛾,:’0’:#1.$;.2*+:1.0$"O2WOW1#%棉铃虫A1)+"’G1.:$$.(+*1.$"4&U!P&#%美国棉铃虫A1)+"’G1.:$ B1$ ">3>>H%#% 草地螟6’<’7#1*17#+"#+"$)+7 "J3Y4%2#% 焦点滨尺蛾 %<$&*1.’&$ :.$##+$.+$ "4&U!d1#% 竹蠹螟 @(:9+7$ ;27"+01&#$)+7"J)J,c3#% 西花蓟马 =.$&>)+&+1))$ ’""+01&#$)+7 "P*oUc,#%柞蚕 !&#91.$1$ :1.&/+"c)!Jd2#% 蒲氏钩蝠蛾 H9+#$.’017:2+"c%d>!%#% 天蚕 !&#91.$1$ /$($($+"O*)/a1#% 温室白粉虱 H.+$)12.’017G$:’.$.+’.2("X)^WH(#% 异色瓢虫 A$.(’&+$ $</.+0+7"X3u222#% 东亚飞蝗 6’"27#$ (+*.$#’.+$ "O1.UV)#% 沙蟋 D./))27;+.(27 "4%-V>)#%西方蜜蜂!:+7(1))+;1.$">’!uR1#%烟粉虱-1(+7+$ #$3$"+"4%WP[)#% 果蝇C.’7’:9+)$ G+.+)+7"’2),*1,3*#% 美洲斑潜蝇6+.+’(/B$ 7$#+G$1"O)-)O(#%三叶草斑潜蝇6+.+’(/B$#.+;’)++"[(YH’%#: 用"H7=@F6?E6=C c@=#7=D@?! %&&&% u71#$)5! %&&*% 虱 -1(+7+$ #$3$"+和 温 室 白 粉 虱 H.+$)12.’017 d<rEs#6=C X<?<I6=A]6! %&&2% [61#$)5!%&’%% u" 1# G$:’.$.+’.2(RAB2& 基因迅速提高表达!说明 RAB2& $)5! %&’%#( 高温和低温胁迫都可以显著诱导灰飞 在两种粉虱高温胁迫中起到一定作用"余昊和万方 虱( 龄若虫体内 67A7:2& 的表达!最大的表达量分 浩! %&&2#( 南极摇蚊 -1)*+"$ $&#$."#+"$ 体内的 别在(& 和 +2N( 翟会芳等"%&’&#的研究也表明 RAB2& 基因能够持续上调来保护冷激对幼虫的伤害 RAB2& 在甜菜夜蛾 ,:’0’:#1.$ 1<+*2$ 高温胁迫中有 "H7=@F6?E1#$)5! %&&1#( 而低温诱导了马铃薯甲虫 明显的保护作用( 高温瞬时热激能诱导 X型烟粉 61:#+&’#$.7$ 01"1()+&1$#$成虫的RAB2&基因的下调 KK*3( 昆虫学报!"#$ %&#’(’)’*+"$ ,+&+"$ )*卷 象也在苹果蠹蛾 8/0+$ :’(’&1))$ 中发现"申建 茹等! %&’’#( 当遇到高温胁迫后昆虫会主动上 调RAB2&蛋白来应对!但是随着热激时间的延长 热激蛋白不断积累!而大量表达热激蛋白需要昆虫 消耗大量的能量物质!此时昆虫为了维持基本的生 命活动而下调 RAB2&!但是表达量还是要高于正常 条件下的 RAB2& 表达量".7#G@?56== 6=C ^6E6?! %&&&#( 在 +(N条件下!67A7:2& 的表达量在处理 后’ F 时达到最大值!随后降低( 因此!我们认为 67A7:2& 可能在灰飞虱抵抗温度胁迫过程中起到关 键的作用( 图(不同发育阶段的灰飞虱67A7:2&5H/J的相对表达水平 灰飞虱是重要的水稻害虫!长期以来由它引起的 a7D:(KH@#6E7I@@‘B?@AA7<= #@I@#A<Z67A7:2& 5H/J7= C7ZZ@?@=EC@I@#<B5@=E6#AE6D@A<Z6$’01):9$<7#.+$#1))27 为害严重影响了水稻的产量和品质( 作为一种本地 /’$’龄若虫’AE7=AE6?=$5BF%/%$%龄若虫%=C7=AE6?=$5BF%/,$, 越冬越夏的害虫!对温度胁迫的耐受能力直接影响其 龄若虫,?C7=AE6?=$5BF%/($(龄若虫(EF7=AE6?=$5BF%/)$)龄若 种群的消长( 为了探讨灰飞虱对环境的适应机制!本 虫)EF 7=AE6?=$5BF% [J$ 雄成虫 [6#@6C"#E% aJ$ 雌成虫 a@56#@ 研究成功克隆了其RAB2&基因全长序列!分析了不同 6C"#E:每个处理,个重复!图中数据为平均值i标准差%柱上不同的 发育阶段67A7:2&的表达变化规律!检测了冷热条件 字母表示在&:&) 水平上有显著差异 "P.c多重比较检验#( 46;F 下67A7:2&的表达水平!阐明了 67A7:2& 可能与其温 E?@6E5@=E7=;#"C@AEF?@@?@B#7;6E@A:^F@C6E66?@C@=<E@C 6A5@6=i,%: c7ZZ@?@=E#@EE@?AAE6=CZ<?EF@A7D=7Z7;6=EC7ZZ@?@=;@6EEF@&:&)#@I@#"P.c 度适应能力有着密切的联系( 当然灰飞虱体内还有 5"#E7B#@;<5B6?7A<=E@AE#: 其他热激蛋白!为了进一步深入探讨它的环境适应机 制!有必要对其他热激蛋白进行进一步研究( 通过系 "蒋健等! %&’,#( 在(&N下处理不同时间后发现! 统阐明热激蛋白家族在灰飞虱环境适应中的作用机 67A7:2& 的表达水平在处理后&:) F 时最高!随着时 制!将会给该虫的发生及暴发成灾机制提供新的理 间的延长!67A7:2& 的表达水平逐渐降低( 类似的现 论!并为开展灰飞虱综合治理提供新的思路( 图)K不同温度’ F处理后灰飞虱(龄若虫67A7:2& 5H/J的相对表达水平 a7D:)KH@#6E7I@@‘B?@AA7<= #@I@#A<Z67A7:2& 5H/J7= EF@(EF 7=AE6?=$5BFA<Z6$’01):9$< 7#.+$#1))27@‘B<A@C E<C7ZZ@?@=EE@5B@?6E"?@Z<?’ F 每个处理,个重复!图中数据为平均值i标准差%星号表示该处理与对照"%1N#比较在&:&)水平上有显著差异 "P.c多重比较检验#%图1 同( 46;FE?@6E5@=E7=;#"C@AEF?@@?@B#7;6E@A:^F@C6E67=EF@Z7D"?@6?@5@6=i,%:^F@6AE@?7A] AE6=CAZ<?A7D=7Z7;6=EC7ZZ@?@=;@G@E\@@= EF@E?@6E5@=E 6=CEF@;<=E?<#"%1N# 6EEF@&:&) #@I@#"P.c5"#E7B#@;<5B6?7A<=E@AE#:^F@A65@Z<?a7D:1: *期 张K青等$ 灰飞虱热激蛋白RAB2&基因的克隆)序列分析与表达模式 KK*3) 图1K(&N"J#和+(N"X#下处理不同时间灰飞虱(龄若虫67A7:2& 5H/J的相对表达水平 a7D:1KH@#6E7I@@‘B?@AA7<= #@I@#A<Z67A7:2& 5H/J7= EF@(EF 7=AE6?=$5BFA<Z 6$’01+:9$<7#.+$#1))27@‘B<A@C E<(&N "J# 6=C +(N "X# Z<?C7ZZ@?@=EE75@ 4.’"110+&*7’;#91O$#+’&$)!"$01(/’;,"+1&"17’;#91F&+#10 ,#$#17 参考文献 $K$1$%$*&$0% ’;!(1.+"$!’&%"((#$’)**(+’)**3: a@C@?[4! R<Z56== W4! ’222:R@6E0AF<;] B?<E@7=A! 5<#@;"#6? J#7[[T! H<@.[! o6"DF6= >d! [@$@?V! V6=6?@E<" X! V7B@?VY! ;F6B@?<=@A! 6=C EF@AE?@AA?@AB<=A@$ @I<#"E7<=6?$6=C @;<#<D7;6# V?<C?<5<" >! V@6?#PR! %&&1:>?$AE6#AE?";E"?@<Z6= RAB2&0 BF$A7<#<D$:!&&2$)?1G+1L’;49/7+’)’*/!1’"’#$%(,+%3%: =";#@<E7C@0B%,k.G6’;#<A@C ;F6B@?<=@;<5B#@‘:O$#2.1!((&$’&’,+ W"BE6H.!’22):VF$#<D@=@E7;6=6#$A7A<ZEF@2&]cF@6EAF<;]Z657#$<Z ’&’*:KK B?<E@7= A@9"@=;@A6=C 6= @‘657=6E7<= <ZEF@?@#6E7<=AF7B 65<=D X6#@!.![6AE@?AW!!R<C]7=A<=-c!J\56]>!X@_@5@?^[!X?<\=o! 6=756#A! B#6=EA! 6=C Z"=D7AB@;7@A:J’)1"2)$.-+’)’*/$&0 X"EE@?Z7@#C!! X"A@J! ><"#A<= !>! a6??6?!! W<<C !4W! R6?E#@$ %G’)2#+’&!’%"1#$’&1,+’&*,: H!!<=@A^R! P7=C?<EF HP! V?@AA[>! .$5?=7<"C7A-! 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