昆虫学报!"#$%&#’(’)’*+"$,+&+"$!!"#"$%&’()!)*"*#$*)1,*12 -./$(’0(12*’34056780&’()0’*0’’) 雷公藤总生物碱对粘虫幼虫神经系统酶活性 及神经递质含量的影响 周9琳(!!! 李俊领(! 刘向阳(! 马志卿&! 冯俊涛&! 张9兴& "(:河南农业大学植物保护学院!河南省新型农药创制与应用重点实验室!郑州M)’’’&% &:西北农林科技大学无公害农药研究服务中心!陕西省生物农药工程技术研究中心!陕西杨凌+(&(’’# 摘要! &目的’明确雷公藤=.+-#1.9*+/(E+)@’.>++Y..5:_:生物碱对粘虫G9#5+(&$ 01-$.$#$ "W>@5DC#神经系统的影 响!为阐明其杀虫作用机制提供依据( &方法’采用载毒叶片法测定粘虫)龄幼虫经雷公藤总生物碱处理后体内乙 酰胆碱酯酶"!L[S#)F>r! RrE!JO>$D)L>&r! ‘#&rE!JO>$D)谷丙转氨酶"POJ#和谷氨酸脱羧酶"P!Z#等重要神经 系统酶活性及乙酰胆碱"!L[#)谷氨酸"P@"#和!E氨基丁酸"P!G!#等神经递质的含量( &结果’雷公藤总生物碱 处理对粘虫)龄幼虫!L[S无明显影响!麻醉期处理粘虫幼虫体内!L[相对含量与同期对照无显著差异( 处理粘 虫幼虫在轻度麻醉期)深度麻醉期和复苏期体内 P!G!和 P@" 含量显著升高!P!G!含量分别升高了*;:*1K! M;:&*K和&’:&;K!P@"含量分别升高了&M:))K!&2:22K和*:(2K( 处理粘虫幼虫POJ活性明显受到抑制!而 P!Z活性无明显变化( 处理明显抑制粘虫幼虫头部F>r! RrE!JO>$D和L>&r! ‘#&rE!JO>$D活性!但对中肠两种 !JO>$D活性影响不大( &结论’研究结果有助于了解雷公藤生物碱对昆虫神经系统的影响!也为进一步阐明其作 用靶标奠定了基础( 关键词! 粘虫% 雷公藤% 总生物碱% 神经系统酶系% 神经递质 中图分类号! T;1):;99文献标识码! !99文章编号!’M)ME1&;1"&’()#’*E’*)1E’* H)),.*&()*(*#$#$V#$(’2&)-(0 7%("0+%58()’ 9(,:&%.(("T,$#&*-#.,#,# (" *+,#.*’J’*’,&()",C-#$,"M%0,&#"2.("*,"*&()",C-(*-#"&0’**,-&’" $#-J#$;501(’<# *+"#%#0# "N,/’2(/*,-#$ <(.*C’2#,# XYQ]H/?(!!! H<U"?EH/?#(! H<]c/>?#EV>?#(! ‘!X[/ET/?#&! hSFPU"?EJ>.&! XY!FPc/?#&"(: YD?>? RD\H>8.C>%.C\._F.=D@OD$%/6/-D>?- !BB@/6>%/.?! L.@@D#D._O@>?%OC.%D6%/.?! YD?>? !#C/6"@%"C>@]?/=DC$/%\! X[D?#g[." M)’’’&! L[/?>%&:aD$D>C6[ LD?%DC._G/.BD$%/6/-DS?#/?DDC/?#>?- JD6[?.@.#\! I[>>?7/OC.=/?6D! aD$D>C6[ >?- [email protected]?%LD?%DC._G/.C>%/.?>@OD$%/6/-D! F.C%[ND$% !#C/6"@%"CD>?- h.CD$%C\]?/=DC$/%\! V>?#@/?#! I[>>?7/+(&(’’! L[/?># !3&*-#.*$ &!/A’ J[D.84D6%/=D._%[/$CD$D>C6[ /$%.-D%DCA/?D%[DD__D6%$._%.%>@>@5>@./-$_C.A =.+-#1.9*+/(E+)@’.>++Y..5:_:.? /?$D6%?DC=."$$\$%DA>?- %.BC.=/-D>8>$/$_.CD@"6/->%/?#/%$ /?$D6%/6/->@AD6[>?/$A$:&‘D%[.-$’ J[D)%[ /?$%>C@>C=>D._G9#5+(&$ 01-$.$#$ "W>@5DC# NDCD_D- N/%[ A>/gD@D>=D$%CD>%D- N/%[ %[D%.%>@>@5>@./-$_C.A=2E+)@’.>++:J[D>6%/=/%/D$._>6D%\@6[.@/?DD$%DC>$D "!L[S#! F>r! RrE!JO>$D! L>&r! ‘#&rE!JO>$D! #@"%>A/6EB\C"=/6%C>?$>A/?>$D"POJ# >?- #@"%>A/6 -D6>C8.7\@>$D"P!Z# /? %[D)%[ /?$%>C@>C=>D._G201-$.$#$ %CD>%D- NDCD-D%DCA/?D- >%%[CDD-/__DCD?% B./$.?/?#$%>#D$! >?- %[D6.?%D?%$._?D"C.%C>?$A/%%DC$/?6@"-/?#>6D%\@6[.@/?D"!L[#! !E>A/?.8"%\C/6 >6/- "P!G!# >?- #@"%>A/6>6/- "P@"# NDCD>@$.>$$>\D-:&aD$"@%$’ J[D!L[S>6%/=/%\/? %[D)%[ /?$%>C@>C=>D._G201-$.$#$ N>$?.%>__D6%D- 8\%[D%.%>@>@5>@./-$_C.A=2E+)@’.>++:J[D!L[ 6.?%D?%$/? %CD>%D- @>C=>D/? %[DND>5 B>C>@\$/$$%>#D>?- %[D-DDB B>C>@\$/$$%>#DNDCD?.%$/#?/_/6>?%@\-/__DCD?%_C.A %[.$D._%[D6.CCD$B.?-/?#%N.6.?%C.@$:J[DP!G!6.?%D?%$/? %CD>%D- @>C=>D/?6CD>$D- 8\*;:*1K!M;:&*K >?- &’:&;K! N[/@D%[DP@" 6.?%D?%$/?6CD>$D- 8\&M:))K!&2:22K >?-*:(2K /? %[DND>5 B>C>@\$/$ 基金项目$国家-十五.科技攻关项目"&’’MG!)(1!’M#%公益性行业"农业#科研专项"&’’;’2’)&#%河南省重点科技攻关项目"’*&(’&2)’’22# 作者简介$周琳!女!(;+(年生!河南南阳人!博士!教授!研究方向为生物农药与农药毒理学!SEA>/@$g[."@/?[D?>"b(12:6.A !通讯作者L.CCD$B.?-/?#>"%[.C!SEA>/@$g[."@/?[D?>"b(12:6.A 收稿日期aD6D/=D-$&’()E’ME’;%接受日期!66DB%D-$&’()E’)E&( *期 周9琳等$ 雷公藤总生物碱对粘虫幼虫神经系统酶活性及神经递质含量的影响 99*)+ $%>#D! %[D-DDB B>C>@\$/$$%>#D>?- %[DCD6.=DC\$%>#D! CD$BD6%/=D@\:J[DPOJ>6%/=/%\/? %CD>%D- @>C=>D N>$CDA>C5>8@\/?[/8/%D- 8\%[D%.%>@>@5>@./-$! 8"%%[DP!Z>6%/=/%\N>$?.%>__D6%D-:J[D>6%/=/%/D$._ F>r! RrE!JO>$D>?- L>&r! ‘#&rE!JO>$D/? %[D8C>/? ._%CD>%D- @>C=>DNDCD/?[/8/%D-! 8"%%[.$D/? %[D A/-#"%-/- ?.%6[>?#D:&L.?6@"$/.?’ J[DCD$"@%$[D@B "$"?-DC$%>?- %[DD__D6%$._%[D>@5>@./-$_C.A=2 E+)@’.>++.? /?$D6%?DC=."$$\$%DA! >?- BC.=/-D_"C%[DC$6/D?%/_/68>$/$_.CCD=D>@/?#%[D/C>6%/.? %>C#D%: 4,% 5(-2&$ G9#5+(&$ 01-$.$#$% =.+-#1.9*+/(E+)@’.>++% %.%>@>@5>@./-$% ?D"C>@D?g\AD$% ?D"C.%C>?$A/%%DC 99从动物)植物和微生物中发现农药活性物质!直 集中在活性测试上!对其杀虫作用机理的相关研究 接利用其原材料创制新农药或从中寻找先导化合 较少!谭浩"&’(’#研究了雷公藤总生物碱对昆虫肌 物!对其进行人工合成和修饰合成以开发更高活性 质网钙泵的影响!胡兆农等"&’’*# 报道粘虫 化合物!是近年来新农药创制的主要途径( 植物在 G9#5+(&$ 01-$.$#$ "W>@5DC# F>r! RrE!JO>$D可能 长期生存竞争中为抵御逆境而形成种类繁多的植物 是雷公藤定碱和雷公藤次碱的一个重要作用靶标( 次生代谢物质!其中大多数对病)虫)草等有害生物 笔者前期研究了粘虫幼虫取食雷公藤总生物碱后体 具有一定的生物调控作用( 国内外新农药研发实践 内几种重要代谢酶系的活性变化"周琳等! &’’*8#! 证明!植物源农药活性物质对有害生物的作用方式 症状观察发现粘虫和小菜蛾 B)/#1))$ 89)’0#1))$ 幼虫 新颖!作用机理独特!易于发现新的分子结构及作用 取食雷公藤总生物碱后均表现为停止取食)麻醉和 靶标"吴文君等! &’’*#( 雷公藤总生物碱是雷公藤 复苏!复苏试虫可再次取食)麻醉和复苏!如此反复! =.+-#1.9*+/(E+)@’.>++Y..5:_:中主要杀虫活性物质! 直至死亡"周琳! &’((#!推测雷公藤生物碱可能作 对鳞翅目)双翅目)鞘翅目等多种昆虫表现出较强的 用于昆虫的神经系统( 本研究以粘虫) 龄幼虫为试 胃毒)拒食)麻醉)生长发育抑制和种群抑制等多种 虫!测试经雷公藤总生物碱处理后试虫体内神经系 特异性杀虫作用"周琳等!&’’1!&’’+!&’(’#!是一 统酶系的活性及神经递质含量的变化!以明确雷公 个很有发展潜力的生物碱杀虫剂( 周琳等"&’’*># 藤生物碱对昆虫神经系统的影响!为进一步阐明其 优化了从雷公藤根皮中大规模提取杀虫用总生物碱 杀虫作用机理及为雷公藤杀虫剂的科学使用提供理 工艺%祝传书等"&’(2#从雷公藤叶愈伤组织诱导的 论依据( 雷公藤胚状体培养体系中已检测到雷公藤生物碱! 为解决其自然资源短缺提供了一条新途径( 目前人 67材料与方法 们已从雷公藤中分离出1 种杀虫生物碱!均具有卫 矛甙骨架"图(#( 6867供试昆虫 目前关于雷公藤生物碱杀虫作用的研究报道多 粘虫G201-$.$#$! 由西北农林科技大学无公害 农药研究服务中心养虫室"温度&) d(e%相对湿度 +’Ki*’K%光照时间(&Hf(&Z#提供的室内种群( 选择个体大小一致)健康)活泼的)龄前期幼虫供试( 6897主要药剂 供试药剂为纯度;)K的雷公藤总生物碱!其提 取分离方法参考林绥等"&’’(#的方法( 将采自福 建泰宁的雷公藤根皮粉碎过M’ 目筛!甲醇室温浸提 M [!超声提取&’ A/?( 反复2 次!合并各提取液!减 压浓缩得浸膏( 浸膏加水后有沉淀物生成!过滤!晾 干成粗粉( 以* 倍量质量分数)KYL@溶液渗漉该 粗粉!渗漉液用浓氨水调至 BY; i(’!静置&M [ 后 过滤!用水洗涤沉淀物( 次!再滤干!1’e干燥!得粗 总生物碱( 用乙醚溶解!醚液用质量分数为(KYL@ 图(9雷公藤杀虫生物碱的结构通式 h/#:(9PD?DC/6$%C"6%"CD._/?$D6%/6/->@>@5>@./-$ 溶液萃取!萃取液以氨水调至 BY; i(’( 放置过 _C.A=.+-#1.9*+/(E+)@’.>++ 夜!过滤出沉淀物!用水洗涤& 次!滤干!1’e干燥! 99*)* 昆虫学报!"#$ %&#’(’)’*+"$ ,+&+"$ )*卷 得白色粉末状总生物碱( 以丙酮E甲醇重结晶!得无 $):! (;;&#( 同时于 Me下解剖出中肠"拉掉围食 色颗粒状总生物碱原药!其含量测定采用紫外分光 膜#!分别按(f(’"N3=#加入冰冷的’:( A.@3HJC/$E 光度法"李琰等! &’’;#( YL@缓冲液!冰浴匀浆!在’ iMe 下M ’’’ C3A/? 离 溴化乙酰胆碱)还原型谷胱甘肽))!)pE二硫双 心 (’ A/?!取上清液为待测酶液"hD?#1#$):! 硝基苯 甲 酸 ")! )pE-/%[/.E8/$E&E?/%C.8D?g./6>6/-! (;;&#( 酶活性测定参照冯北元和徐慕禹"(;*(#) ZJFG#)!JO钠盐)考马斯亮蓝 PE&)’ 均为 I/#A>公 何运转等"(;;;! &’’(#的方法( 每处理重复2 次( 司产品%乌本甘"Q">8>/?#为 h@"5>公司产品%其他 以每分钟每毫克蛋白催化产生的磷的量"?A.@O/3 试剂均为国产分析纯( A#BC./A/?#来表示酶比活力( 68:7试虫处理 68A7<#W# 4WR!EO#&,和T#9W# PL9WR!EO#&,离 采用载毒叶片法"刘惠霞等! &’’2#( 取若干头 体活性测定 试虫!饥饿处理* [ 后!随机分为对照组和处理组( 取(’’ 头试虫的头部及中肠!称重后加入(’ 倍 处理组中每头试虫饲喂点涂( #H( ’’’ A#3H雷公 体积的冰冷的 ’:( A.@3HJC/$EYL@缓冲液!冰浴匀 藤总生物碱的玉米叶碟"’:) 6Ao’:) 6A#!对照组 浆!在’ iMe下M ’’’ C3A/? 离心(’ A/?!上清液即 饲喂点涂( #H丙酮的玉米叶碟"’:) 6Ao’:) 6A#! 为待测酶液"hD?#1#$):! (;;&#( 酶活性测定方法 一叶( 虫!单头单皿饲养( 取* [ 内食完整个叶碟 同活体活性( 每处理重复2 次( 的幼虫供试( 分别取轻度麻醉期)深度麻醉期)复苏 68U7谷氨酸"L$C*#0’.#.’2# I$C$和 !R氨基丁酸 期的中毒试虫"处理试虫#和相应的同期对照试虫 "!R#0’"(3C*%-’.#.’2# I!X!$含量测定 进行各项测试( 采用G>65A>? (&( 型氨基酸分析仪测定( 分别 68= 7 乙 酰 胆 碱 酯 酶 "#.,*%$.+($’",,&*,-#&,# 取各中毒期试虫和对照试虫各&’ 头!分别称重后! !T+H$活性测定 加入 *’K乙醇研磨!过滤至蒸发皿中!以 )’ AH 分别取各中毒期试虫和对照试虫各&’ 头!剪取 *’K乙醇冲洗滤渣!将滤液于 1’e恒温水浴中蒸 试虫头部"带少量胸部#!加入2 AH’:& A.@3HBY 干! 然 后 加 入 磺 基 水 杨 酸 沉 淀 蛋 白 质! 用 +:1磷酸缓冲液冰浴匀浆!所得匀浆液定容至 M:’ G>5DA>?(&(‘G型氨基酸分析仪测定 P@" 和 P!G! AH!’ iMe下以M ’’’ C3A/? 离心() A/?!上清液即 的含量"以每(’’ #鲜重试虫中含有的毫克数#( 每 为待测酶液( 酶活性测定参照 P.C"? 等改进的 处理重复2 次( S@@A>?法"高希武!(;*+#的方法进行( 蛋白含量测 68S7谷丙转氨酶"L$C*#0’.R/%-CJ’.*-#"&#0’"#&,# 定采用考马斯亮蓝 PE&)’ 法"GC>-_.C-! (;+1#( 酶 IOE$活性测定 活力以每毫克蛋白每&’ A/? 水解生成的硫代胆碱 分别取各中毒期试虫和对照试虫各&’ 头!分别 的量"#A.@3A#BC./&’ A/?#表示( 称重后!按(f2"N3=#加入磷酸缓冲液!冰浴匀浆后 68?7乙酰胆碱"#.,*%$.+($’",# !T+$含量测定 于(’ ’’’ C3A/? 离心2’ A/?!取上清液作为待测酶 分别取各中毒期试虫和对照试虫各 )’ 头!在 液( 参照广东农林科学院蚕桑系"(;+)#和陈钧辉 ’ iMe下剪取头部!分成两份!一份"!#用 ’:’1+ 等"&’’2#的测定方法( 每处理重复2 次( 酶比活 A.@3HBY+:& 磷酸缓冲液匀浆!另一份"G#用含有 力用每毫克蛋白每分钟催化生成的丙酮酸钠的量 ’:’& A.@3HQ!QE二甲基EQE"&!&E二氯乙烯基#磷酸 "?A.@3A#BC./A/?#表示( 酯的上述缓冲液匀浆!并用各自的缓冲液定容至 686Y7谷氨酸脱羧酶"L$C*#0’.2,.#-3(Z%$#&,# &:’ AH!于*)’ C3A/?冷冻离心() A/?!取上清液待 I!>$活性测定 测( !L[含量测定采用羟胺法"J"C?DC! (;++#( 每 分别取各中毒期试虫和对照试虫各 &’ 头!按 处理重复2 次( (f2"N3=#加入硼酸缓冲液!冰浴匀浆后于(’ ’’’ C3 68@7<#W# 4WR!EO#&,和T#9W# PL9WR!EO#&,活 A/?离心2’ A/?!取上清液待测( 酶活性测定参照 体活性测定 陈钧辉等"&’’2#的方法进行( 每处理重复 2 次( 分别取各中毒期试虫和对照试虫各 )’ 头!在 酶比活力用每分钟每毫克蛋白催化生成的 LQ 的 & ’ iMe下剪取头部!以 (f;"N3=#加入冰冷的 ’:( 释放量表示( A.@3HJC/$EYL@缓冲液!冰浴匀浆!在’ iMe下M ’’’ 68667数据统计与分析 C3A/? 离心 (’ A/?!上清液即为待测酶液"hD?#1# 实验数据初步使用 S76D@软件进行初期统计分 *期 周9琳等$ 雷公藤总生物碱对粘虫幼虫神经系统酶活性及神经递质含量的影响 99*); 析!后期采用专业数据统计软件 IOII"lDC$/.? 相对含量与同期对照无显著差异%复苏期 !6[ 含量 (1:’#中!FQl!方法进行方差分析!并用 J"5D\检 则显著低于对照( 但分析 !L[ 相对含量的变化不 验比较数据之间的差异显著性( 足以导致其神经传导的受阻( 9897雷公藤总生物碱对粘虫? 龄幼虫 <#W# 4WR 97结果 !EO#&,和T#9W# PL9WR!EO#&,活体活性的影响 9:9:69对中毒试虫头部F>r! RrE!JO>$D和L>&r! 9867雷公藤总生物碱对粘虫? 龄幼虫 !T+H活性 ‘#&rE!JO>$D活性的影响$ 由表& 可以看出!粘虫) 与!T+含量的影响 龄幼虫经雷公藤总生物碱处理后!头部 F>r! RrE 从表( 可以看出!雷公藤总生物碱处理试虫在 !JO>$D比活力在各中毒期均显著低于同期对照!表 轻度麻醉期的 !L[S活力较同期对照有所升高!但 明供试药剂可明显抑制试虫头部 F>r! RrE!JO>$D 差异不显著%深度麻醉期和复苏期处理试虫 !L[S 活性!轻度麻醉期)深度麻醉期和复苏期的酶抑制率 经J"5D\检验与同期对照相比无显著差异( 可见! 分别为&+:+;K! 21:M1K和&&:*2K( 雷公藤总生物碱对粘虫!L[S无明显的抑制或激活 从表& 还可看出!中毒试虫在轻度麻醉期)深度 作用!可初步判断 !L[S不是雷公藤总生物碱对试 麻醉期和复苏期!其头部 L>&r! ‘#&rE!JO>$D活性均 虫的主要作用靶标( 显著低于相应对照!抑制率分别为(M:*&K!21:12K和 由表( 还可知!处理试虫在麻醉期体内 !L[ 的 2&:;MK( 表67雷公藤总生物碱对粘虫?龄幼虫!T+H活性和!T+含量的影响 E#3$,67H)),.*&()*(*#$#$V#$(’2&)-(07%("0+%58()’9(,:&%.((("!T+H#.*’J’*% #"2!T+.("*,"* ’"*+,?*+’"&*#-$#-J#,();501(’<# *+"#%#0# 乙酰胆碱酯酶"!L[S#活性!L[S>6%/=/%\ 乙酰胆碱"!L[#相对含量!L[6.?%D?% 取样时期 处理 对照 比值 处理 对照 比值 I>AB@/?#BDC/.- JCD>%AD?% L.?%C.@ a>%/. JCD>%AD?% L.?%C.@ a>%/. "#A.@3A#BC./&’ A/?# "#A.@3A#BC./&’ A/?# "JC3LR# "#A.@3AH# "#A.@3AH# "JC3LR# 轻度麻醉期 ’:&2(d’:’’1 > ’:&(*d’:’’M > (:’1 ’:&*1d’:’’& > ’:&;’d’:’’2 > ’:;; WDD5B>C>@\$/$$%>#D 深度麻醉期 ’:&(Md’:’’) > ’:&&(d’:’’) > ’:;+ ’:&;2d’:’’2 > ’:&*;d’:’’& > (:’( ZDDBB>C>@\$/$$%>#D 复苏期 ’:&’2d’:’’+ > ’:&(1d’:’’) > ’:;M ’:&1*d’:’’) 8 ’:&*)d’:’’) > ’:;M aD6.=DC\$%>#D 谷胱甘肽含量标准曲线J[DCD#CD$$/.?D^">%/.?._PIY6.?%D?%$As,’:’’2&2*r2:+112’’P".s’:;;;;#%蛋白质含量标准曲线J[DCD#CD$$/.? D^">%/.?._BC.%D/?6.?%D?%$As’:’&1M’’r’:’’&2+2P".s’:;;(*#%!6[含量标准曲线J[DCD#CD$$/.?D^">%/.?._!6[6.?%D?%$As,’:’’’2;&r ’:(M)*)2P".s’:;;;;#:表中数据为2次重复的平均值d标准差%表中同一指标同行数据标不同字母者表示差异显著"Bk’:’)! J"5D\检 验#%表中对照为与处理试虫相对应的同期未经药剂处理试虫( 下表同(Z>%>/?%[D%>8@D>CD#/=D?8\AD>?d,3_C.A2 -"B@/6>%/.?$>?-%[.$D._ %[D$>ADB>C>AD%DCN/%[/?>C.N_.@@.ND-8\-/__DCD?%@D%%DC$>CD$/#?/_/6>?%@\-/__DCD?%"Bk’:’)!8\J"5D\,$%D$%#:L.?%C.@$/?%[D%>8@DAD>?"?%CD>%D- /?$D6%$N/%[%[D%.%>@>@5>@./-$/?%[D$>AD$>AB@/?#BDC/.->$%CD>%D-/?$D6%$:J[D$>AD_.C%[D_.@@.N/?#%>8@D$: 表97雷公藤总生物碱对粘虫?龄幼虫头部<#W# 4WR!EO#&,和T#9W# PL9WR!EO#&,活性的影响 E#3$,97H)),.*&()*(*#$#$V#$(’2&)-(07%("0+%58()’9(,:&%.((("<#W# 4WR!EO#&,#"2T#9W# PL9WR!EO#&,#.*’J’*’,& ’"*+,3-#’"()*+,?*+’"&*#-$#-J#,();501(’<# *+"#%#0# F>r!RrE!JO>$D活性 L>&r!‘#&rE!JO>$D活性 F>r!RrE!JO>$D>6%/=/%\ L>&r!‘#&rE!JO>$D>6%/=/%\ 取样时期 处理 对照 处理 对照 抑制率"K# 抑制率"K# I>AB@/?#BDC/.- JCD>%AD?% L.?%C.@ JCD>%AD?% L.?%C.@ <?[/8/%/.? <?[/8/%/.? "#A.@3A# "#A.@3A# "#A.@3A# "#A.@3A# C>%D C>%D BC./&’ A/?# BC./&’ A/?# BC./&’ A/?# BC./&’ A/?# 轻度麻醉期 ’:&;+d’:’(( 8 ’:M((d’:’(’ > &+:+; ’:&+Md’:’(1 8 ’:2&(d’:’(+ > (M:*& WD>5B>C>@\$/$$%>#D 深度麻醉期 ’:&1)d’:’’) 6 ’:M(+d’:’() > 21:M1 ’:&’Md’:’(( 8 ’:2&2d’:’’+ > 21:12 ZDDBB>C>@\$/$$%>#D 复苏期 ’:2&’d’:’21 8 ’:M()d’:’’) > &&:*2 ’:&&(d’:’’1 8 ’:2&;d’:’(’ > 2&:;M aD6.=DC\$%>#D 磷含量标准曲线J[DCD#CD$$/.?D^">%/.?._B[.$B[.C"$6.?%D?%$ As’:’’2++(r&’:(;*M’’P".s’:;;;+#% 蛋白质含量标准曲线J[DCD#CD$$/.? D^">%/.?._BC.%D/?$As’:&M**’’r(:(*)’’o(’,2P".s’:;;M’#:表2同J[D$>AD_.CJ>8@D2: 99*1’ 昆虫学报!"#$ %&#’(’)’*+"$ ,+&+"$ )*卷 9:9:99对中毒试虫中肠F>r! RrE!JO>$D和L>&r! 酶抑制率分别为&:’&K!(’:++K和(1:(&K( 由表 ‘#&rE!JO>$D的影响$ 由表2 可知!中毒试虫 F>r! 2还可以看出!L>&r! ‘#&rE!JO>$D比活力只有在深 RrE!JO酶比活力在轻度麻醉期与同期对照无显著 度麻醉期显著低于同期对照!酶抑制率为&’:M)K!而 差异!而深度麻醉期和复苏期均显著低于同期对照! 其他中毒期处理试虫酶比活力与相应对照无差异( 表:7雷公藤总生物碱对粘虫?龄幼虫中肠<#W# 4WR!EO#&,和T#9W# PL9WR!EO#&,活性的影响 E#3$,:7H)),.*&()*(*#$#$V#$(’2&)-(07%("0+%58()’9(,:&%.((("<#W# 4WR!EO#&,#"2T#9W# PL9WR!EO#&,#.*’J’*’,& ’"*+,0’2LC*()*+,?*+’"&*#-$#-J#,();501(’<# *+"#%#0# F>r!RrE!JO>$D活性 L>&r!‘#&rE!JO>$D活性 F>r!RrE!JO>$D>6%/=/%\ L>&r!‘#&rE!JO>$D>6%/=/%\ 取样时期 处理 对照 抑制率 处理 对照 抑制率 I>AB@/?#BDC/.- JCD>%AD?% L.?%C.@ "K# JCD>%AD?% L.?%C.@ "K# "#A.@3A# "#A.@3A# <?[/8/%/.? "#A.@3A# "#A.@3A# <?[/8/%/.? BC./&’ A/?# BC./&’ A/?# C>%D BC./&’ A/?# BC./&’ A/?# C>%D 轻度麻醉期 ’:&1Md’:’() > ’:&+’d’:’(1 > &:’& ’:&)1d’:’’+ 8 ’:&;)d’:’2’ > (2:M1 WD>5B>C>@\$/$$%>#D 深度麻醉期 ’:&2;d’:’’) 8 ’:&1*d’:’’+ > (’:++ ’:&21d’:’’; 8 ’:&;+d’:’(2 > &’:M) ZDDBB>C>@\$/$$%>#D 复苏期 ’:&&1d’:’(’ 8 ’:&+’d’:’’; > (1:(& ’:&1*d’:’() > ’:2’(d’:’(; > (’:*; aD6.=DC\$%>#D 98:7雷公藤总生物碱对粘虫? 龄幼虫 <#W# 4WR 98=7雷公藤总生物碱对粘虫 ? 龄幼虫 I$C和 !EO#&,和T#9W# PL9WR!EO#&,离体活性的影响 I!X!含量的影响 测定了&)’!)’’!( ’’’!& ’’’ 和 M ’’’ ##3AH 由表M 可看出!粘虫) 龄幼虫在不同中毒期!体 ) 个不同剂量的雷公藤总生物碱对粘虫) 龄幼虫头 内P@" 和 P!G!含量明显高于其同期对照!表明雷 部和中肠 F>r! RrE!JO>$D和 L>&r! ‘#&rE!JO>$D 公藤总生物碱对这& 种神经递质含量有显著影响( 离体活性的影响!结果表明!雷公藤总生物碱对试虫 在轻度麻醉期)深度麻醉期和复苏期!处理幼虫体内 头部和中肠的两种 !JO酶均无明显的抑制或激活 P!G!含量分别升高*;:*1K!M;:&*K和&’:&;K! 作用( P@"含量分别升高&M:))K! &2:22K和*:(2K( 表=7雷公藤总生物碱对粘虫?龄幼虫体内谷氨酸和!R氨基丁酸含量的影响 E#3$,=7H)),.*&()*(*#$#$V#$(’2&)-(07%("0+%58()’9(,:&%.((("I!X!#"2I$C.("*,"*& ’"*+,?*+’"&*#-$#-J#,();501(’<# *+"#%#0# 谷氨酸含量P@"6.?%D?%"A#3(’’ ## !E氨基丁酸含量P!G!6.?%D?%"A#3(’’ ## 取样时期 比值a>%/. 比值a>%/. I>AB@/?#BDC/.- 处理JCD>%AD?% 对照L.?%C.@ 处理JCD>%AD?% 对照L.?%C.@ "JC3LR# "JC3LR# 轻度麻醉期 2+:1;d(:)& > 2’:&1d(:(+ 6 (:&) (:2(d’:’& > ’:1;d’:’2 - (:;’ WD>5B>C>@\$/$$%>#D 深度麻醉期 2+:2&d’:M’ > 2’:&1d(:(+ 6 (:&2 (:’2d’:’& 8 ’:1;d’:’2 - (:M; ZDDBB>C>@\$/$$%>#D 复苏期 2&:+&d’:*& 8 2’:&1d(:(1 6 (:’* ’:*2d’:’( 6 ’:1;d’:’2 - (:&’ aD6.=DC\$%>#D 98?7雷公藤总生物碱对粘虫 ? 龄幼虫 IOE和 虫体内P!Z比活力与同期对照相比无显著差异!表 I!>活性的影响 明雷公藤总生物碱对粘虫P!Z活性无影响"表)#( 由表) 可以看出!试虫各中毒期的 POJ比活力 均显著小于同期对照!表明雷公藤总生物碱对中毒 :7讨论与结论 试虫体内 POJ活性有明显的抑制作用!轻度麻醉 期)深度麻醉期和复苏期的酶抑制率分别为 粘虫幼虫取食雷公藤总生物碱后的症状学观察 2’:)MK! 22:&+K和2):()K( 不同中毒期处理幼 表明其作用于昆虫神经系统!但其作用机制有别于 *期 周9琳等$ 雷公藤总生物碱对粘虫幼虫神经系统酶活性及神经递质含量的影响 99*1( 表?7雷公藤总生物碱对粘虫?龄幼虫谷丙转氨酶和谷氨酸脱羧酶活性的影响 E#3$,?7H)),.*&()*(*#$#$V#$(’2&)-(07%("0+%58()’9(,:&%.((("L$C*#0#*,R/%-CJ’.*-#"&#0’"#&,"IOE$ #"2L$C*#0’. 2,.#-3(Z%$#&,"I!>$ #.*’J’*’,&’"*+,?*+’"&*#-$#-J#,();501(’<# *+"#%#0# 谷丙转氨酶活性POJ>6%/=/%\ 谷氨酸脱羧酶活性P!Z>6%/=/%\ 处理 处理 取样时期 对照 对照 比值 JCD>%AD?% 抑制率"K# JCD>%AD?% I>AB@/?#BDC/.- L.?%C.@"?A.@3A# L.?%C.@"#H3A# a>%/. "?A.@3A# <?[/8/%/.?C>%D "#H3A# BC./A/?# BC./A/?# "JC3LR# BC./A/?# BC./A/?# 轻度麻醉期 +:+2d’:(; 8 ((:(&d’:*’ > 2’:)M ):M&d’:&1 >8 ):&*d’:(1 >8 (:’2 WD>5B>C>@\$/$$%>#D 深度麻醉期 +:2;d’:’& 8 ((:’*d’:2( > 22:&+ M:;&d’:2& 8 ):&2d’:(1 >8 ’:;M ZDDBB>C>@\$/$$%>#D 复苏期 +:&’d’:’M 8 ((:(’d’:(( > 2):() ):1)d’:M& > ):2&d’:(1 >8 (:’1 aD6.=DC\$%>#D 传统的神经毒剂"周琳! &’((#( 本研究发现雷公藤 说明突触前膜兴奋性神经递质的减少可能不是麻醉 总生物碱对中毒试虫体内 !L[S活性无明显影响! 的真正原因( 本实验测定结果表明!中毒试虫 这与中毒试虫没有出现有机磷)氨基甲酸酯类杀虫 P!G!含量显著升高!且随中毒程度的加深而升高! 剂那样明显的兴奋症状也是相吻合的( 这些研究均 这可能是雷公藤总生物碱致中毒试虫麻醉的一个重 初步表明!L[S不是雷公藤总生物碱的主要作用靶 要原因( 进一步分析!如果药剂作用于昆虫神经E肌 标( 并且分析中毒试虫神经递质 !L[ 含量的变化 肉突触后膜"肌细胞膜#上的 P!G!受体!诱导受体 不足以影响甚至阻断神经冲动的传导而出现软瘫麻 构象改变!使L@,离子通道开放!L@,迅速涌入膜内! 痹( 六六六作用于昆虫中枢神经的突触前膜!促进 使膜超极化!从而使动作电位不能产生!神经系统的 !L[的释放!导致 !L[ 含量显著升高%巴丹作用于 正常动作电位传导受到破坏!试虫即表现出行动迟 昆虫突触后膜上的乙酰胆碱受体!阻断了接受 !L[ 缓)麻醉症状( 那么肌细胞膜上的 P!G!受体是否 的功能!!L[ 含量也明显升高!而本实验测定中毒 是雷公藤生物碱导致昆虫麻醉的真正靶标!尚有待 试虫体内!L[含量无明显变化!这进一步表明雷公 通过电生理等技术进一步研究证实( 藤总生物碱不象六六六和巴丹那样作用于神经突 F>r! RrE!JO>$D和 L>&r! ‘#&rE!JO>$D不但 触( 由此可初步判断!乙酰胆碱激性突触不是雷公 存在于昆虫的神经系统中!在中肠)肌肉等活动比较 藤总生物碱的作用部位( 强烈的组织或器官中均大量存在( 神经系统中 前期通过症状学观察推测雷公藤总生物碱可能 F>r! RrE!JO>$D和 L>&r! ‘#&rE!JO>$D可影响轴 象阿维菌素一样作用于昆虫的神经E肌肉接点!致使 突运输)神经递质的释放及神经质膜的稳定性%此 兴奋性传导被阻断!试虫表现出肌肉松弛)虫体软瘫 外!在神经细胞内还有许多被 L>&r活化的受体!如 等症状( 在昆虫中!P@" 和 P!G!都是神经E肌肉突 钙调蛋白"L>‘#)肌钙蛋白 L和钙调素"冷欣夫等! 触部位的神经递质!P@" 是兴奋性递质!其作用和脊 (;;1#( F>r! RrE!JO>$D和 L>&r! ‘#&rE!JO>$D活 椎动物的!L[相同!与其受体结合后能产生兴奋性 性若被抑制!必然会影响细胞膜上离子通道的开放 突触后电位( 其在 P!Z的作用下灭活而生成 或关闭!使细胞膜两侧离子平衡和渗透平衡失常!继 P!G!!而P!G!是抑制性递质!作用和 !L[ 相反! 而导致神经系统功能紊乱!最终使昆虫死亡( 宁黔 与其受体结合后能产生抑制性突触后电位"刘惠霞 冀和尚稚珍"(;;1#)HD?#等"(;;)#)何运转等 等! (;;*#( 正常情况下!神经传导是依赖兴奋性突 "(;;;#以及‘>%$"A"C>和 P[/>$"--/?"(;+;#报道拟 触和抑制性突触的精确平衡来协调( P@" 和 P!G! 除虫菊酯类杀虫剂对不同昆虫中枢神经系统 F>r! 的含量发生变化!即会影响正常的神经传导!从而使 RrE!JO>$D和L>&r! ‘#&rE!JO>$D活力均有较强的 机体表现中毒症状( 本研究中麻醉试虫体内 P@" 含 抑制作用!F>r! RrE!JO>$D和 L>&r! ‘#&rE!JO>$D 量显著升高!这与同科南蛇藤属植物扶芳藤根部麻 是拟除虫菊酯类杀虫剂的靶标位点之一( 本研究结 醉成分使麻醉粘虫体内P@"含量升高的毒理学研究 果表明!雷公藤总生物碱也能显著抑制粘虫活体 结果相似"任志刚等! (;;*#%马志卿等"&’’2#报道 F>r! RrE!JO>$D和L>&r! ‘#&rE!JO>$D活性!这种 阿维菌素致麻痹粘虫体内 P@" 含量也是升高的!这 抑制作用最终会严重影响机体细胞的代谢生长!破 99*1& 昆虫学报!"#$ %&#’(’)’*+"$ ,+&+"$ )*卷 坏其神经细胞的传导功能!从而使试虫表现出特异 %&#’(’)’*+"$)V&’E)1>*1!&M"M#$ &M) ,&M1:*高希武! (;*+: 行为!如拒食)麻醉)生长发育抑制等( 但雷公藤总 P.C"?等改进的S@@A>?胆碱酯酶活性测定方法介绍:昆虫知 识!&M"M#$&M),&M1+ 生物碱在离体条件下不能抑制 F>r! RrE!JO>$D和 YDVX! H/‘! hD?#PH! W>?#VL! (;;;:<?[/8/%/.? ._B\CD%[C./- L>&r! ‘#&rE!JO>$D的活性!这说明在活体条件下& /?$D6%/6/-D$.? ?DC=DF>r! RrE!JO>$D/? [."$D_@/D$"G/0"$ 种 !JO>$D被显著抑制可能是雷公藤总生物碱对神 >’(10#+"$#:!"#$%&#’(’)’*+"$,+&+"$!M&"(#$(;,&M:*何运转! 经系统影响的后效应( 李梅! 冯国蕾! 王荫长!(;;;:拟除虫菊酯对家蝇F>r! RrE 雷公藤总生物碱对粘虫幼虫乙酰胆碱酯酶 !JO>$D抑制作用的研究:昆虫学报!M&"(#$(;,&M+ YDVX! H/‘! YDhT! hD?#PH! W>?#VL! &’’(:<?[/8/%/.? ._ "!L[S#活性无明显影响%麻醉期粘虫幼虫体内 B\CD%[C./- /?$D6%/6/-D$.? ?DC=DL>E!JO>$D! L>E‘#E!JO>$D/? !L[的相对含量与同期对照无显著差异( 中毒试 [."$D_@/D$"G/0"$>’(10#+"$#:!"#$%&#’(’)’*+"$,+&+"$!MM"2#$ 虫在轻度麻醉期)深度麻醉期和复苏期!体内 P!G! &;+,2’2:*何运转!李梅!何凤琴!冯国蕾!王荫长!&’’(:拟 和P@"含量显著升高%雷公藤总生物碱可明显抑制 除虫菊酯对家蝇L>E!JO>$D和L>E‘#E!JO>$D的抑制作用:昆虫 粘虫幼虫谷丙转氨酶"POJ#的活性!对谷氨酸脱羧 学报!MM"2#$&;+,2’2+ 酶"P!Z#活性无明显影响( 雷公藤总生物碱可明 Y"XF!L[D?#Z!Z>/VH! I[/GU!&’’*:L.?%>6%>6%/.? ._N/@_.C-/?D >?- N/@_.C/?D_C.A=.+-#1.9*+/(59-’*)$/"/(>?- %[D/CD__D6%$.? 显抑制粘虫幼虫头部 F>r! RrE!JO>$D和 L>&r! F>rERrE!JO>$D>6%/=/%/D$._G9#5+(&$ 01-$.$#$:?5+&101J’/.&$) ‘#&rE!JO>$D活性!但对中肠两种 !JO>$D活性影响 ’@B10#+"+>1,"+1&"1!(’"(#$+),+;:*胡兆农! 程丹! 戴亚丽! 不大( 通过分析可知!乙酰胆碱激性突触不是雷公 师宝君!&’’*:昆明山海棠杀虫活性成分雷公藤定碱和雷公藤 藤总生物碱的作用部位%昆虫的神经E肌肉接点可能 次碱的触杀作用及对F>rERrE!JO酶活性的影响:农药学学 是雷公藤总生物碱的作用部位之一%雷公藤总生物 报!(’"(#$+),+;+ 碱对粘虫体内 F>r! RrE!JO>$D和 L>&r! ‘#&rE HD?#ch! J>?#XY! W>?#VL! (;;1:‘.@D6"@>CJ.7/6.@.#\._ <?$D6%/6/-D$>?- <?$D6%aD$/$%>?6D:L[/?>!#C/6"@%"CDOCD$$! !JO>$D的影响可能是其对神经系统影响的后效应( GD/4/?#:+,*:*冷欣夫!唐振华!王荫长!(;;1:杀虫药剂分子 毒理学及昆虫抗药性:北京$中国农业出版社:+,*+ 参考文献 ";,),-,".,&$ HD?#ch! c/>.ZT! (;;): S__D6%._-D@%>AD%[C/? .? BC.%D/? B[.$B[.C\@>%/.? ._[."$D_@\8C>/? $\?>B%.$.AD$:B10#+"+>1,"+1&"1! GC>-_.C- ‘‘!(;+1:!C>B/->?-$D?$/%/=DAD%[.-_.C%[D^">?%/%>%/.?._ MM"(#$**,*;: A/6C.#C>A^">?%/%/D$._BC.%D/? "%/@/g/?#%[DBC/?6/B@D._BC.%D/?E-\D H/V! hD?#UJ! I[/cV! W" VV! X[>?#c! &’’;:I%"-\.? %[D 8/?-/?#:!&$)9#+"$):+’"51(+0#.9!+&"(,&#$&M*,&)M: -D%DCA/?>%/.? ._%C/B%.@/-D>?- %.%>@>@5>@./-$/? =.+-#1.9*+/( L[D? UY! J>.H! H/U! X[" WY! V">? VI! &’’2:G/.6[DA/$%C\ E+)@’.>++Y..5:_:6"@%"CD$:?5+&101J’/.&$)’@B10#+"+>1,"+1&"1!(( S7BDC/AD?%$:2C-D-:I6/D?6DOCD$$!GD/4/?#:**,(’’:*陈钧辉! "2#$21+ ,2+&:*李琰! 冯俊涛! 史晓燕! 吴勇延! 张兴! 陶力!李俊!朱婉华!袁玉荪!&’’2:生物化学实验"第2版#: &’’;:雷公藤组培产物中雷公藤甲素和总生物碱含量的测定: 北京$科学出版社:**,(’’+ 农药学学报!(("2#$21+,2+&+ ZDB>C%AD?%._IDC/6"@%"CD>?- I/@5! P">?#-.?#!6>-DA\._!#C/6"@%"C>@ H/?I!H/VL!I>5"C>/F!H/?Uh!U/?UU!&’’(:I%"-\._$D$^"/%DCBD?D >?-h.CD$%C\I6/D?6D$!(;+):S__D6%._4"=D?/@D[.CA.?D>?>@.#$.? >@5>@./-$_C.A=.+-#1.9*+/(E+)@’.>++Y..5:_:!"#$ B5$.($"1/#+"$ %[D>6%/=/%/D$._#@"%>A/6>6/-EB\C"=/6>6/- %C>?$>A/?>$D/? %[D B.$%DC/.CB.C%/.? ._$/@5 #C>?- /? :’(;98(’.+2!"#$ %&#’(’)’*+"$ ,+&+"$!21"&#$((1,((;:*林绥!李援朝!樱井信子!林建峰! ,+&+"$!(*"M#$212,211:*广东农林科学院蚕桑系!(;+):昆 金静君! &’’(:雷公藤倍半萜生物碱的研究:药学学报! 21 虫保幼激素类似物对家蚕后部丝腺谷氨酸E丙酮酸转氨酶活性 "&#$((1,((;+ 的影响:昆虫学报!(*"M#$212,211+ H/" Yc! H/cP! W" WU! (;;*:S?%.A.@.#\G/.6[DA/$%C\:I[>>?7/ hD?#GV!c"‘V!(;*(:!$D?$/%/=DAD%[.-_.C-D%DCA/?/?#%[D>6%/=/%\ I6/D?6D>?-JD6[?.@.#\OCD$$!c/,>?:&&2,&&):*刘惠霞!李新 ._F>r! RrE!JO>$D._$\?>B%.$.AD$/? A."$D8C>/?:B.’*.100+& 岗!吴文君!(;;*:昆虫生物化学:西安$ 陕西科学技术出版 :+’"51(+0#.9$&>:+’-590+"0!*"&#$M*,M;:*冯北元! 徐慕禹! 社:&&2,&&)+ (;*(:大鼠脑突触体F>ERE!JO>$D活力的微量测定方法:生物 H/"Yc!V>?#LU!H/>?cY!W"WU!&’’2:S__D6%$._6D@>?#"@/?l.? 化学与生物物理进展!*"&#$M*,M;+ A"$6@D6D@@$._G9#5+(&$ 01-$.$#$:!"#$ %&#’(’)’*+"$ ,+&+"$! M1 hD?#PH! U>6^"D$a‘! L@>C5 U‘! (;;&:I"BBCD$$/.? ._B\CD%[C./-E "M#$M(+,M&2:*刘惠霞!杨从军!廉喜红!吴文君!&’’2:苦皮 -DBD?-D?%?D"C.%C>?$A/%%DCCD@D>$D_C.A$\?>B%.$.AD$._5?.65-.N?E 藤素l对东方粘虫肌细胞的影响:昆虫学报!M1"M#$M(+,M&2+ CD$/$%>?%[."$D_@/D$"?-DCB"@$D-E-DB.@>C/g>%/.? 6.?-/%/.?$-"C/?# ‘>XT! L[D? !H! hD?#UJ! H/PX! X[>?#c! &’’2:J[D8/.>6%/=/%\ 6.?%/?"."$BDC_"$/.?:B10#+"+>1:+’"51(+0#.9$&> B590+’)’*9! M& 6.AB>C/$.? 8D%NDD? >8>AD6%/? >?- _/BC.?/@>#>/?$%>CA\N.CA! "(#$1M,++: G9#5+(&$01-$.$#$:?5+&101J’/.&$)’@B10#+"+>1,"+1&"1!)"M#$2+, P>.cW! (;*+:<?%C.-"6%/.? ._S@@A>? BC.6D-"CD_.C>$$>\._ M(:*马志卿!陈安良!冯俊涛!李广泽!张兴!&’’2:阿维菌素 6[.@/?D$%DC>$D$/?6C"-DD?g\A>%/6BCDB>C>%/.?$A.-/_/D- 8\P.C"?: 和氟虫腈对粘虫的毒杀作用比较:农药学学报!)"M#$2+,M(+ *期 周9琳等$ 雷公藤总生物碱对粘虫幼虫神经系统酶活性及神经递质含量的影响 99*12 ‘>%$"A"C>h!P[/>$"--/?I‘!(;+;L[>C>6%DC/$%/6$._ZZJE$D?$/%/=DL>E 22"M#$M’(,M’1:*周琳!冯俊涛!马志卿!张兴!&’’1:雷公 !JO>$D/?%[D>7.?/6ADA8C>?D:<?$J.$[/.FD-:FD"C.%.7/6.@.#\._ 藤总生物碱对粘虫的生物活性:植物保护学报!22"M#$M’(, <?$D6%/6/-D$>?-O[DC.A.?D$:O@D?"AOCD$$!FDNV.C5:&M),&)+: M’1+ F/?#TU! I[>?#XX! 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