3/11/2013 Microbial ecology of amphibian  skin Ben Fitzpatrick Ecology & Evolutionary Biology University of Tennessee Microbial ecology of amphibian skin • The environment • Cutaneous biodiversity • Host defense and  sseelleeccttiivviittyy • Conflict and  cooperation 3/11/2013 Ben Fitzpatrick, University of Tennessee Microbial ecology of amphibian skin • The environment –Importance of skin in  amphibian ecology –Climate –Skin structure –Skin secretions 3/11/2013 Ben Fitzpatrick, University of Tennessee 1 3/11/2013 Importance of skin in amphibian  ecology • Respiration • Sensation • Absorb/release HO 2 • Heat exchange • Cocoon in drought • Chemical defense • Concealment/warning • Protection from abrasion  & pathogens (Stebbins and Cohen 1995) 3/11/2013 Ben Fitzpatrick, University of Tennessee The environment: Climate • Amphibians have limited  capacity to  thermoregulate • Temperature and  Humidityy – Warmer, wetter  environments: More  bacteria • pH – Might be most important  environmental variable in  global diversity 3/11/2013 Ben Fitzpatrick, University of Tennessee The environment: Skin structure animalbiology101.tumblr.com  3/11/2013 Ben Fitzpatrick, University of Tennessee 2 3/11/2013 The environment: Skin structure • Naked, permeable • Stratum corneum: Outermost layer • Sloughing continuous or episodic 3/11/2013 Ben Fitzpatrick, University of Tennessee The environment: Skin secretions • Mucus glands – Moisture, lubrication,  mechanical trap – Mucins: gel‐forming  glycoproteins • Granular glands – Pheromones – Defensive compounds: • Amines • Steroids • Alkaloids • Peptides http://vertebrateproject.wikispaces.com 3/11/2013 Ben Fitzpatrick, University of Tennessee The environment: Review • Skin a major interface in  • Microbes have to contend  amphibian ecology with • Constant contact with  – Sloughing (disturbance) microbe‐rich media – Toxic secretions • EExxtteerrnnaall eennvviirroonnmmeenntt  – Other microbes probablyinfluential • Microbes might gain – Abiotic – Enemy‐free space – Biotic – Nutritious secretions • Amphibian skin  – Opportunity for infection structurally & chemically  complex 3/11/2013 Ben Fitzpatrick, University of Tennessee 3 3/11/2013 Cutaneous biodiversity • Resident vs. transient  microbes • Growth forms • AAbbuunnddaannccee • Diversity within and  among individuals • Lauer et al. (2007)Copeia2007: 630‐640 3/11/2013 Ben Fitzpatrick, University of Tennessee Cutaneous biodiversity • Resident:  – Grow/multiply on skin – Consistent abundance – Attached • Transient – Non‐reproducing – Exogenous – Lie free • Composition of samples  in rinse water significantly  • Lauer et al. (2007)Copeia2007: 630‐640 different from samples of  remaining (attached)  bacteria 3/11/2013 Ben Fitzpatrick, University of Tennessee Cutaneous biodiversity • Growth forms –Distinct rods, cocci –Smallmicrocolonies? –No evidence of biofilms • Lauer et al. (2007)Copeia2007: 630‐640 3/11/2013 Ben Fitzpatrick, University of Tennessee 4 3/11/2013 Cutaneous biodiversity • Abundance • Plethodon cinereus –Based on SEM (Lauer et  al. 2007): –Average 17 million per  cm2 –Fairly even distribution –Sometimes aggregated  in/near glands 3/11/2013 Ben Fitzpatrick, University of Tennessee Cutaneous biodiversity • Abundance • Rhinellamarina –Based on cultivable plate  counts (Meyer et al.  2012): –Average 0.5 to 2 million  per cm2 –Depends on location  (dorsal vs. ventral) and time since moult 3/11/2013 Ben Fitzpatrick, University of Tennessee Cutaneous biodiversity • Composition (16s RNA) Pond‐dwelling larvae  (McKenzie et al. 2011) ‐100’s of OTU’s ‐Mostly ‐proteobacteria ‐Differences between  salamanders (Ambystoma)  and frogs (Rana, Pseudacris 3/11/2013 Ben Fitzpatrick, University of Tennessee 5 3/11/2013 Cutaneous biodiversity • Composition (16s RNA) Pond‐dwelling larvae  Terrestrial  (McKenzie et al. 2011) plethodontids(Allison ‐100’s of OTU’s 2012) ‐Mostly ‐proteobacteria ‐100’s of OTU’s ‐Differences between  ‐Mostly ‐proteobacteria salamanders (Ambystoma)  ‐No consistent differences  and frogs (Rana, Pseudacris) among Plethonjordaniand  Desmognathusocoee 3/11/2013 Ben Fitzpatrick, University of Tennessee Cutaneous biodiversity • Plethodontidsin GSMNP • Human (Roth & James 1988) – Nevskia() – Microccoci(Actinobacteria) – Hydrocarboniphaga() – Staphylococci (Firmicutes) – Koribacter(Acidobacteria) – Corynebacterium(Actinobacteria) – Burkholderia() – Propionibacteria(Actinobacteria) – PPseuddomonas(()) – AAciinettobbactter(()) • Pseudacristadpoles in AZ – Curvibacter() – Actinomycetales(Actinobacteria) – Sphingomonas() – Pseudomonadaceae() – Nevskia() 3/11/2013 Ben Fitzpatrick, University of Tennessee Cutaneous biodiversity • Terrestrial  plethodontidsin  0P-4.teya-2halee0 05 SimGiSlaMr N“sPpecies” to other  -4-2-20 P.jordani Axis 2-15-10-5 logs salamanders moist surfaces in the  -0-4 D.ocoee -10 -5Axis 10 5 habitat -4-2 0 Rocks Different variants within  -2 “species” -40 Logs 0 -2 -2 -4 -4 -4 -2 0-4 -2 0-4 -2 0-4 -2 0-4 -2 0 3/11/2013 Ben Fitzpatrick, University of Tennessee 6 3/11/2013 Cutaneous biodiversity • Terrestrial  plethodontidsin  GSMNP Similarity of microbial  ccoommmmuunniittiieess oonn  salamanders depends  more on proximity than  species I.e., interactions are  diffuserather than  specificor pairwise 3/11/2013 Ben Fitzpatrick, University of Tennessee Cutaneous biodiversity • Plethodontidsin  GSMNP Salamander skin and  cover objects have very  ssiimmiillaarr bbaacctteerriiaall  community structure. Specific strains or species  differ between  salamander skin and  cover objects. 3/11/2013 Ben Fitzpatrick, University of Tennessee Cutaneous Biodiversity: Review • Distinct resident flora on  • Diffuse rather then specific  amphibian skin interactions • Millions per cm2: 10x to  – Subtle differences between  100x that of human skin co‐occurring tadpoles and  salamander larvae • Single cells or microcolonies – No differences between co‐ •• 110000’ss ooff OOTTUUss ooccccuurrrriinngg PPlleetthhooddoonn,  • Composition very different  Desmognathus from human skin • Community structure  similar between  • Composition different  salamanders and cover  between pond‐dwelling and  objects terrestrial amphibians • Genetic differentiation  between host‐associated  and free‐living populations 3/11/2013 Ben Fitzpatrick, University of Tennessee 7 3/11/2013 Host defense and selectivity • Resistance and  Containment • Antimicrobial Secretions • SSlloouugghhiinngg • Selectivity 3/11/2013 Ben Fitzpatrick, University of Tennessee Host defense and selectivity • Resistance and  Containment –Stratum corneum –Mucus http://vertebrateproject.wikispaces.com 3/11/2013 Ben Fitzpatrick, University of Tennessee Host defense and selectivity • Resistance and  Containment –Stratum corneum –Mucus • Antimicrobial Secretions http://vertebrateproject.wikispaces.com 3/11/2013 Ben Fitzpatrick, University of Tennessee 8 3/11/2013 Host defense and selectivity Antimicrobial Secretions • Amines –Histamines, epinephrine, adrenalin, bufotenins • Steroids –bbuffaddenolliddes–anesthhetics, carddiac stimullants • Alkaloids –100’s of compounds in poison dart frogs, sequestered  from prey • Peptides –Likely most important antimicrobial compounds 3/11/2013 Ben Fitzpatrick, University of Tennessee Host defense and selectivity Sloughing (Meyer et al. 2012) • Disturbance/recolonization dynamics • May prevent “fouling” via  biofilmformation • May increase vulnerability  to opportunistic pathogens • Sloughed skin often eaten 3/11/2013 Ben Fitzpatrick, University of Tennessee Host defense and selectivity • Evidence of selectivity -4 -2 0 5 –Resident vs. transient  0P.teyahalee 0 –fSlaolraamanders vs. cover  -4-2-20 P.jordani Axis 2-15-10-5 logs salamanders obbjjectts -4-0 D.ocoee -10 -5Axis 10 5 -2 -4 0 Rocks -2 -4 0 Logs 0 -2 -2 -4 -4 -4 -2 0-4 -2 0-4 -2 0-4 -2 0-4 -2 0 3/11/2013 Ben Fitzpatrick, University of Tennessee 9 3/11/2013 Host defense and selectivity • Salamanders vs. cover  objects – Work in progress: Swabbed zigzag salamanders  and cover objects GGeennoottyyppeedd PPsseeuuddoommoonnaass isolates Only one strain found on  cover objects: P. putida 11 distinct strains found co‐ occurring on salamanders 7 related to a pathogen of  fish 3/11/2013 Ben Fitzpatrick, University of Tennessee Host defense and selectivity • Salamanders vs. cover  objects –Work in progress: Salamanders harbor a  distinctand more diverse assemblage of  Pseudomonas Do salamanders select a  beneficial flora, or are  they under attack? 3/11/2013 Ben Fitzpatrick, University of Tennessee Host Defense and Selectivity: Review • Barrier: Stratum corneum • Trap: Mucus • Poison: Antibiotic secretions • Removal: Sloughing Selection for certain microbial genotypes over  others Prevention of competitive dominance? 3/11/2013 Ben Fitzpatrick, University of Tennessee 10